李珊珊 張 萌 王 威 王 昕 陳玉嬌 陰赪宏 王一鵬

隨著高齡高危孕婦比例增加和輔助生殖技術的蓬勃發(fā)展，近年來，雙胎妊娠的出生率從2.2%增長到3.0%，增加了雙胎妊娠產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的復雜性和難度[1,2]。由于傳統(tǒng)的產(chǎn)前血清學篩查技術對雙胎妊娠孕婦胎兒染色體非整倍體篩查能力有限，既往雙胎妊娠孕婦多通過侵入性產(chǎn)前診斷排除胎兒染色體病。但傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查的假陽性率及侵入性產(chǎn)前診斷流產(chǎn)、感染等發(fā)生的風險性，給孕婦造成焦慮和恐慌，也降低了孕婦對侵入性產(chǎn)前診斷的依從性[3～5]。近年來隨著分子遺傳技術的飛速發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal test, NIPT)等技術受到越來越多的關注和應用。有研究表明，相較于傳統(tǒng)的血清學生化指標的產(chǎn)前篩查方法，NIPT檢測雙胎非整倍體的準確性更高，假陽性率更低，其檢測雙胎非整倍體的準確性接近于單胎檢測[6]。

NIPT檢測流程較為復雜，其質量控制影響因素較多，其中胎兒游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)濃度與NIPT的準確性密切相關，為保證NIPT的準確性，cfDNA濃度至少達到4%的最低檢測濃度標準[7,8]。本研究擬對筆者醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進行NIPT的雙胎妊娠孕婦就診及測序數(shù)據(jù)進行回顧性分析，評價雙胎妊娠孕婦進行NIPT的cfDNA濃度可能存在的影響因素。

對象與方法

1.研究對象：回顧性研究2019年1～12月于首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診，接受NIPT的3900例孕婦臨床信息，其中雙胎妊娠孕婦244例，單胎妊娠孕婦3656例。依據(jù)本實驗室NIPT的質控標準，當檢測樣本cfDNA濃度<3.5%時，判斷為不合格，經(jīng)過孕婦知情同意后進行二次采血檢測。當二次采血檢測cfDNA濃度≥3.5%，判為合格，并以二次采血樣本作為檢測對象進入之后測序數(shù)據(jù)分析；當二次采血檢測cfDNA濃度<3.5%，判為檢測失敗，無法得出準確測序數(shù)據(jù)分析結果。本研究已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會的批準(倫理審批號：2019-KY-046-01)，依據(jù)《孕婦外周血游離胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術規(guī)范》,所有參與研究的孕婦均簽署知情同意書接受NIPT檢測。

2.研究方法：分組回顧性整理歸納雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT檢測的篩查年齡、采樣孕周分布，分析不同篩查年齡、采樣孕周的雙胎/單胎妊娠孕婦cfDNA濃度的差異。

結 果

1.研究對象基本特征：依據(jù)本實驗室NIPT的質控標準，排除連續(xù)兩次檢測cfDNA濃度<3.5%的樣本，即入組分析雙胎妊娠孕婦241例和單胎妊娠孕婦對照3639例。雙胎妊娠孕婦平均篩查年齡為31.72±3.45歲，平均采樣孕周為15.30±1.94周，平均cfDNA濃度為8.84%±3.96%；單胎妊娠孕婦平均篩查年齡為33.14±3.73歲，平均采樣孕周為16.19±2.94周，平均cfDNA濃度為8.45%±3.50%(表1)。

雙胎妊娠孕婦中篩查年齡25～29歲、30～34歲占比較高，分別為66例(27.39%)和119例(49.38%)；單胎妊娠孕婦對照組30～34歲、35～39歲占比較高，分別為1482例(40.73%)和1369例(37.62%)。

表1 雙胎/單胎妊娠孕婦一般資料分析

雙胎/單胎妊娠孕婦，采樣孕周均集中在12～19周，16～17周占比最高，分別為96例(39.83%)和1022例(28.08%)。

2.雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT篩查年齡對cfDNA濃度的影響：以不同年齡分組，20～24歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲和≥40歲年齡組的雙胎妊娠孕婦與單胎的cfDNA濃度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 不同篩查年齡的雙胎/單胎妊娠孕婦cfDNA濃度對比

3.雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT采樣孕周對cfDNA濃度的影響：以不同采樣孕周分組，12～13周、14～15周和≥20周組的雙胎與單胎妊娠孕婦的cfDNA濃度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，16～17周、18～19周組的雙胎妊娠孕婦cfDNA濃度高于同組單胎(P<0.05，圖2)。

圖2 不同采樣孕周的雙胎/單胎妊娠孕婦cfDNA濃度對比

4.雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT建庫成功率對比：244例雙胎妊娠孕婦中，7例因cfDNA濃度<3.5%首次采血建庫檢測不合格，其成功率為97.13%。經(jīng)知情同意后對首次采血建庫不合格孕婦行二次采血建庫，4例檢測成功，其成功率為57.14%。

3656例單胎妊娠孕婦中，34例因cfDNA濃度<3.5%首次采血建庫檢測不合格，其成功率為99.07%。經(jīng)知情同意后對首次采血建庫不合格孕婦行二次采血建庫，17例檢測成功，其成功率為50.00%。

雙胎妊娠孕婦NIPT首次采血建庫成功率低于單胎(P<0.05)，單胎妊娠孕婦NIPT首次采血建庫成功的可能性高于雙胎；雙胎妊娠孕婦二次采血建庫成功率與單胎比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；雙胎與單胎妊娠孕婦NIPT總體成功率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT建庫成功率差異分析

討 論

中國是出生缺陷高發(fā)國之一，出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬例，出生缺陷兒給社會和家庭帶來了巨大的經(jīng)濟負擔和精神壓力[9]。染色體病是造成出生缺陷的重要原因之一，患者常常具有智力低下、器官畸形及性功能低下等一系列臨床癥狀。研究表明，雙胎妊娠發(fā)生染色體異常和嚴重并發(fā)癥的風險明顯高于單胎妊娠[10]。傳統(tǒng)單胎妊娠的產(chǎn)前篩查是通過血清學生化指標和超聲影像學篩查評估胎兒染色體異常的風險性，但雙胎妊娠母體血清生化指標水平受多個胎兒的影響，異常值被正常胎兒平均，使其產(chǎn)前篩查方式更具有復雜性，其血清學生化篩查的準確性不如單胎準確，所以臨床多采取侵入性產(chǎn)前診斷的方式檢測胎兒染色體作為雙胎妊娠產(chǎn)前診斷的金標準。不同于傳統(tǒng)血清學篩查，NIPT技術具有無創(chuàng)性、檢出率高、敏感度高等特點，對雙胎妊娠孕婦也有較高的篩查價值，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)篩查方法。

NIPT檢測流程較為復雜，因采樣失敗、cfDNA濃度低、生物信息學等測序數(shù)據(jù)質控不合格等均能造成檢測失敗。其中cfDNA濃度是影響NIPT檢測的成功率和準確性重要因素。為保證NIPT的成功率和準確性，cfDNA濃度至少達到4%的最低檢測濃度標準。孕婦外周血中cfDNA，是因胎兒細胞通過胎盤進入母體血循環(huán)被母體免疫系統(tǒng)破壞，致其DNA以游離的形式存在于母體外周血中。有研究分析，與單胎比較，雙胎妊娠孕婦NIPT的cfDNA檢測失敗受孕婦年齡、孕周、雙絨毛膜雙胎等因素影響[11,12]。

目前，我國依據(jù)《中華人民共和國母嬰保健法實施辦法》、《產(chǎn)前診斷技術管理辦法》及《雙胎妊娠產(chǎn)前篩查與診斷技術規(guī)范(2021年更新版)》等要求，無論單胎或雙胎妊娠，產(chǎn)前篩查的年齡仍按照其適用指征，預產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦推薦進行產(chǎn)前診斷[13～15]。有研究發(fā)現(xiàn)，31歲的雙胎妊娠孕婦與35歲單胎妊娠孕婦胎兒患染色體非整倍體三體綜合征的風險一致，建議修正雙胎妊娠產(chǎn)前診斷的年齡[16]。2000年，加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada,SOGC)發(fā)布建議32歲以上的雙絨毛膜雙胎妊娠孕婦進行產(chǎn)前診斷[17]。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)分析顯示，雙胎妊娠孕婦NIPT檢測篩查年齡不同于單胎，主要集中在25～34歲，而單胎妊娠孕婦的篩查年齡主要集中在30～39歲。雖然雙胎/單胎妊娠的篩查年齡分布不同，但不同篩查年齡組雙胎妊娠孕婦的cfDNA濃度與單胎比較差異無統(tǒng)計學意義，除外≥40歲組，其他不同年齡組cfDNA濃度均可達到8%以上，25～29歲組其cfDNA濃度均值達到9%以上。所以建議對于雙胎妊娠孕婦可根據(jù)其產(chǎn)前診斷等臨床指征及考慮其個人意愿等情況，可選擇適當提前NIPT的篩查年齡，以保證NIPT檢測的成功率和準確性。

除外個體差異，一般來講孕婦外周血中cfDNA濃度會隨著其孕周增加而增加，與采樣孕周呈正相關[18]。本研究中，NIPT檢測雙胎、單胎妊娠采樣孕周均集中在12～19周，其中16～17周占比最高；在不同采樣孕周，雙胎妊娠孕婦cfDNA濃度均高于單胎孕婦，在不同采樣孕周組的cfDNA濃度均已經(jīng)達到8%以上，達到4%的單胎最低檢測濃度標準的2倍以上，且當采樣孕周為18周及以上時，其cfDNA濃度均值達到10%以上，為單胎妊娠的同孕周組近1.25倍。故建議以臨床指征為基礎，對于雙胎妊娠孕婦可適當延后采樣孕周，保證NIPT檢測的成功率和準確性。

有研究發(fā)現(xiàn)，NIPT檢測孕婦中因cfDNA濃度低而造成檢測失敗占0.1%～6.1%，與單胎妊娠比較，雙胎妊娠的cfDNA檢測失敗率升高[11,19]。本研究因cfDNA濃度低于3.5%引起雙胎妊娠孕婦NIPT的失敗率為1.23%，符合2016年我國頒布的《國家衛(wèi)生計生委辦公廳關于有序開展孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷工作的通知》對檢測失敗<5%的要求。本研究中，而雙胎妊娠NIPT檢測首次采血建庫成功率低于單胎(P<0.05)，單胎妊娠孕婦NIPT檢測首次采血建庫成功的可能性高于雙胎；經(jīng)過二次采血后，雙胎與單胎妊娠孕婦NIPT總體成功率分別為99.54%和98.77%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明對于雙胎妊娠，可通過適當延后采樣孕周，提高檢測的cfDNA濃度以提高NIPT的成功率。

目前臨床應用雙胎妊娠NIPT檢測多是采用孕婦外周血中胎兒游離的總DNA含量作為cfDNA濃度來進行評估，無法分辨出雙胎中單一cfDNA所占的比例。但因雙胎妊娠的遺傳的復雜性，單卵雙胎因其相同的遺傳背景，適用于4%的單胎最低檢測濃度標準；而雙卵雙胎的遺傳物質不一致，而孕婦外周血總游離DNA含量達到最低檢測4%的濃度標準時，結果可能被所占比例較大的胎兒結果所掩蓋，造成假陽性或假陰性的結果[20]。鑒于雙胎妊娠特殊性和其NIPT檢測的局限性，應用NIPT作為產(chǎn)前篩查檢測時，應充分知情告知雙胎妊娠孕婦其技術不能檢測所有染色體的異常，不能替代侵入性產(chǎn)前診斷。同時，雙胎妊娠孕婦cfDNA個體差異較大，可根據(jù)其臨床指征，對雙胎妊娠孕婦的NIPT篩查年齡及孕周做出適宜選擇，適當提前NIPT篩查年齡、延后采樣孕周，以減少因cfDNA濃度不足造成NIPT的檢測失敗。