賴文濤 張曉璐 張春陽(yáng) 趙志軍

各種原因引起的骨缺損、骨不愈合是臨床工作中的難題之一。這些情況可能會(huì)使得患者機(jī)體功能發(fā)生障礙，為患者帶來(lái)諸多不便。目前，自體骨移植是比較優(yōu)先的治療選擇。然而，自體骨移植物的獲取可能造成更多的并發(fā)癥，如血腫、感染、供體部位的功能障礙和疼痛，以及手術(shù)時(shí)間的增加等[1]。這使得自體骨可獲取的部分十分有限，限制了其在大面積骨缺損中的應(yīng)用。然而使用異體骨也有包括感染或免疫排斥等在內(nèi)的缺點(diǎn)[2]，并且在一些動(dòng)物研究中也表明，異體骨在誘導(dǎo)新生骨方面的效果較差。為了克服這種局限性，研究人員已經(jīng)開發(fā)了幾種生物材料和方法來(lái)修復(fù)大面積的骨缺損[3]。迄今為止，骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在骨組織工程中的應(yīng)用較為廣泛，但BMSCs的獲取會(huì)給患者帶來(lái)較大痛苦[4-6]。近些年，脂肪干細(xì)胞（adipose stem cells，ADSCs）作為間充質(zhì)干細(xì)胞的替代來(lái)源受到了更多的關(guān)注，因?yàn)樗菀讖牟煌慕馄什课猾@得，微創(chuàng)手術(shù)的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較低，供體部位發(fā)病率也較低[7-8]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-超家族的成員之一，也是誘導(dǎo)新骨形成的最有效的因子。其中，Bmp2是成骨能力較強(qiáng)的蛋白，在骨再生過(guò)程的許多階段發(fā)揮著重要作用[9]。在本研究中，筆者試圖發(fā)掘ADSCs作為骨缺損修復(fù)細(xì)胞治療劑的有效性，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Bmp2基因至大鼠ADSCs中，從而在體外產(chǎn)生大量的Bmp2；再者即評(píng)估Bmp2轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞后其成骨能力是否有增加；最后比較了Bmp2轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的成骨潛力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

選取大鼠脂肪干細(xì)胞，購(gòu)自普諾賽（武漢）生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材

超聲裂解儀（美國(guó)Fisher Scientific公司）、低溫離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）、水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、蛋白電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)Bio-rad公司）、脫色搖床（美國(guó)Thermo公司）、發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）、便攜式勻漿儀（美國(guó)Thermo公司）、PCR儀（美國(guó)Eppendorf公司）、Real-timePCR儀（美國(guó)ABI-7900公司）、激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。茜素紅試劑盒（北京Solarbio公司）、堿性磷酸酶染色劑（北京Solarbio公司）、質(zhì)粒大提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、DMEM培養(yǎng)基（大連美侖生物技術(shù)有限公司）、胎牛血清（美國(guó)Gbico公司）、胰酶（北京利維寧生物科技有限公司）、PBS緩沖液（北京利維寧生物科技有限公司）、Bmp2一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、Smad1/5一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、P-Smad1/5一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、OPN一抗（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）、Dlx2一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、驢抗兔二抗（北京金普來(lái)生物技術(shù)有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）、q-PCR mix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）、OPN引物（生工生物工程(上海)有限公司）、Dlx2引物（生工生物工程(上海)有限公司）、-actin引物（生工生物工程(上海)有限公司）。

1.3 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)

復(fù)蘇脂肪干細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好后，進(jìn)行傳代，吸去培養(yǎng)基，以無(wú)菌PBS緩沖液沖洗后，加入胰酶消化，在鏡下觀察到細(xì)胞皺縮后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行傳代，完全培養(yǎng)基采用90%DMEM培養(yǎng)基（右旋葡萄糖、左旋谷氨酰胺、丙酮酸鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸）加入10%胎牛血清配比而成。

1.4 過(guò)表達(dá)Bmp2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒干粉離心，加入無(wú)酶水溶解，抽取質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴后熱激，并迅速置于冰上，將感受態(tài)細(xì)胞加入到無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 rpm進(jìn)行搖菌，搖菌完成后使用涂布器將菌液均勻涂至卡那霉素抗性平板中培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單克隆菌落至卡那霉素抗性液體培養(yǎng)基中37℃，200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜，將完成培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒大提，提取完成的質(zhì)粒測(cè)濃度。使用Thermo Lippo 3000試劑盒將過(guò)表達(dá)Bmp2質(zhì)粒與脂肪干細(xì)胞共孵育進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 脂肪干細(xì)胞成骨基因相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測(cè)

轉(zhuǎn)染72 h后，獲取脂肪干細(xì)胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶/磷酸酶抑制劑，超聲破碎后，離心并收集上清液用于提取蛋白。再測(cè)定每組樣品的蛋白濃度。用蛋白電轉(zhuǎn)槽將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再以5%脫脂牛奶室溫封閉，TBST清洗后使用抗Bmp2一抗、抗Smad1/5一抗、抗P-Smad1/5一抗、抗OPN一抗、抗Dlx2一抗，抗-actin一抗在4℃條件下孵育過(guò)夜，用綴合辣根過(guò)氧化物酶的驢抗兔和山羊抗小鼠抗體孵育，TBST清洗后在化學(xué)發(fā)光成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況。所有實(shí)驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)至少3次。

1.6 免疫熒光染色

熒光染色前將Vector組和過(guò)表達(dá)Bmp2組細(xì)胞于24孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛中室溫固定，固定完成用PBS清洗，使用10%山羊血清室溫封閉后直接使用OPN特異性一抗于4℃孵育過(guò)夜，孵育完成后使用PBST清洗，使用Alexa 488熒光二抗避光孵育，使用PBST避光清洗后進(jìn)行DAPI核染，最后甘油封片，使用尼康A(chǔ)1共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。

1.7 脂肪干細(xì)胞茜素紅及堿性磷酸酶（ALP）染色

吸取茜素紅染色劑，分別注入Vector組和過(guò)表達(dá)Bmp2組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，室溫染色，超純水清洗后，在熒光倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果；吸取ALP染色劑，分別注入Vector組和過(guò)表達(dá)Bmp2組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在37℃搖床中染色，超純水清洗后在熒光倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，蛋白條帶及熒光強(qiáng)度均使用Image J進(jìn)行分析，運(yùn)用 檢驗(yàn)比較兩組間的差異，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)Bmp2對(duì)脂肪干細(xì)胞茜素紅（ARS）染色、堿性磷酸酶（ALP）染色的影響

通過(guò)對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，筆者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Bmp2組細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)Vector組更加深染的茜素紅染色，通過(guò)對(duì)茜素紅進(jìn)行定量，筆者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Bmp2組細(xì)胞相比Vector組，茜素紅染色更深，表明細(xì)胞礦化增強(qiáng)。同樣，過(guò)表達(dá)Bmp2組較Vector組顯示出更明顯的ALP染色，證明礦化程度增強(qiáng)（見圖1）。

圖1 A.茜素紅染色分析脂肪干細(xì)胞過(guò)表達(dá)Bmp2后細(xì)胞表面鈣鹽沉積情況，堿性磷酸酶染色檢測(cè)硫化鈷沉淀，以判別堿性磷酸酶活性，標(biāo)尺=50 m；B.ARS定量測(cè)定；C.ALP活性測(cè)定

2.2 過(guò)表達(dá)Bmp2對(duì)脂肪干細(xì)胞成骨基因蛋白表達(dá)的影響

與Vector組相比，過(guò)表達(dá)Bmp2組脂肪干細(xì)胞的Bmp2蛋白表達(dá)顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05）。p-Smad1/5的表達(dá)也在過(guò)表達(dá)組有顯著提升（＜0.05），而Bmp下游信號(hào)基因Smad1/5的表達(dá)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。筆者通過(guò)檢測(cè)成骨基因Dlx2與OPN的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)Bmp2組中Dlx2與OPN的表達(dá)相比Vector組有顯著提升（＜0.05），見圖2。

圖2 A.蛋白印跡分析過(guò)表達(dá)Bmp2后大鼠脂肪干細(xì)胞Smad1/5、p-Smad1/5、OPN、Dlx2的表達(dá)情況及驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率；B.Bmp2蛋白表達(dá)的量化情況；C.Smad1/5蛋白表達(dá)的量化情況；D.Dlx2蛋白表達(dá)的量化情況；E.OPN蛋白表達(dá)的量化情況；F.p-Smad1/5蛋白表達(dá)的量化情況

2.3 過(guò)表達(dá)Bmp2對(duì)脂肪干細(xì)胞OPN熒光表達(dá)的影響

通過(guò)免疫熒光標(biāo)記OPN對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，筆者檢測(cè)到過(guò)表達(dá)Bmp2組細(xì)胞的OPN熒光強(qiáng)度顯著高于Vector組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見圖3。

圖3 A.免疫熒光分析過(guò)表達(dá)Bmp2對(duì)脂肪干細(xì)胞骨橋蛋白OPN表達(dá)的影響，最右側(cè)圖為40倍鏡視野下OPN表達(dá)情況；B.OPN熒光強(qiáng)度的量化統(tǒng)計(jì)

3 討論

本研究的重點(diǎn)是有效地利用ADSCs成骨潛力，來(lái)促進(jìn)骨再生，達(dá)到臨床廣泛應(yīng)用的目的。通過(guò)簡(jiǎn)單的手術(shù)，可以很容易地獲得足夠數(shù)量的ADSCs，與其他類型干細(xì)胞類似，具有干細(xì)胞的基本特征及多向分化潛力[10]。而Bmp2作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-家族中的一員，在骨的生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用。為驗(yàn)證Bmp2對(duì)激活脂肪干細(xì)胞成骨分化的潛能，筆者選取大鼠脂肪干細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染Bmp2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒來(lái)檢測(cè)脂肪干細(xì)胞的成骨分化能力。通過(guò)對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨染色分析，筆者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Bmp2后細(xì)胞礦化明顯增強(qiáng)，茜素紅染色結(jié)果提示細(xì)胞周圍鈣鹽沉積明顯增強(qiáng)，而堿性磷酸酶染色結(jié)果則表現(xiàn)出更多的硫化鈷沉淀，說(shuō)明細(xì)胞的堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng)。有研究指出，在實(shí)驗(yàn)室條件下1周內(nèi)，ADSCs在分化過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的礦化作用，并在隨后的每一代中均能保持其干細(xì)胞特征[11]。目前，ADSCs的成骨分化需要的時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)，而脂肪組織提取物的收集率較低。因此，為了加速骨再生，需要用各種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子預(yù)處理ADSCs。有研究表明，Bmp2在添加生長(zhǎng)因子或是細(xì)胞因子后可以誘導(dǎo)ADSCs成骨分化。Risa等[12]分離人脂肪源性干細(xì)胞，觀察重組人Bmp2（rhBmp2）和外源性添加Ca2+的作用，發(fā)現(xiàn)rhBmp2可促進(jìn)hASCs內(nèi)鈣沉積，刺激參與hASCs成骨分化的6種蛋白：Runx 2、Osterix、堿性磷酸酶、骨連接蛋白、骨唾液蛋白和骨鈣素的mRNA及蛋白表達(dá)。這與筆者的結(jié)果高度相似。如能對(duì)ADSCs進(jìn)行特定的功能分析，并發(fā)現(xiàn)其定向分化的方法，以便已確定的干細(xì)胞可以立即進(jìn)行臨床應(yīng)用，避免漫長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。

雖然用Bmp2預(yù)處理ADSCs的結(jié)果是有效的，而且許多臨床試驗(yàn)已經(jīng)成功，但還有幾個(gè)問(wèn)題有待解決，如明確產(chǎn)生并發(fā)癥的Bmp2劑量、Bmp2在體內(nèi)的半衰期及成本問(wèn)題。因此，局部Bmp基因治療已被認(rèn)為是從目標(biāo)ADSCs中分泌Bmp的一種替代方式[13]。Bmp基因誘導(dǎo)的ADSCs不僅具有旁分泌和自分泌功能，可分泌靶向蛋白，分化為骨形成細(xì)胞，參與新骨形成[13]，這種模式也在本研究中得到了證實(shí)。對(duì)過(guò)表達(dá)Bmp2的ADSCs進(jìn)行基于成骨相關(guān)基因的蛋白檢測(cè)，使我們得到了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和可重復(fù)性的結(jié)果，并通過(guò)qRT-PCR及免疫熒光進(jìn)行了驗(yàn)證。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞在過(guò)表達(dá)Bmp2后Bmp下游通路中的Smad1/5表達(dá)無(wú)明顯改變，p-Smad1/5的表達(dá)則明顯升高，這提示Bmp可能使Smad1/5發(fā)生磷酸化而起到成骨分化作用。而進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也表明成骨相關(guān)蛋白Dlx2與OPN的表達(dá)上調(diào)同樣較為顯著。免疫熒光的結(jié)果同樣提示過(guò)表達(dá)Bmp2促進(jìn)成骨相關(guān)基因OPN的表達(dá)。除此之外，由于本次實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，與使用慢病毒轉(zhuǎn)染相比，其轉(zhuǎn)染時(shí)效較為短暫，無(wú)法長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)Bmp2及相關(guān)成骨基因在脂肪干細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，不能確定隨著時(shí)間推移，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性的變化情況，雖然質(zhì)粒介導(dǎo)的基因治療的表達(dá)周期較短，但這種特性不一定是缺陷，在某些不需要長(zhǎng)期的基因表達(dá)的情況下可能是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，如傷口愈合，額外的基因表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致其他嚴(yán)重的問(wèn)題。Alden等[14]指出，短期Bmp基因表達(dá)不僅足以啟動(dòng)組織形成的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，而且可能有利于防止組織過(guò)度生長(zhǎng)，因長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)Bmp2可能引起骨質(zhì)增生、骨刺形成等并發(fā)癥。這促使人們對(duì)時(shí)間及空間控制骨再生的策略進(jìn)行研究，如采用支架控釋Bmp2，使其在一定時(shí)間內(nèi)能持續(xù)定量輸送Bmp2到指定位置，減少異位骨化、骨關(guān)節(jié)炎等并發(fā)癥的產(chǎn)生。Krishnan等[15]使用海藻酸鹽構(gòu)建載體支架以控釋Bmp2在大鼠股骨臨界性節(jié)段缺損模型中的應(yīng)用，雖然與膠原蛋白海綿載體相比，其控釋速度較慢，且在第12周時(shí)的骨缺損面積較多，但膠原蛋白組的異位骨化率更高，這證實(shí)高劑量的Bmp2容易引起異位骨化，以及新骨形成的數(shù)量及空間模式取決于載體及遞質(zhì)。因此，質(zhì)粒作為過(guò)表達(dá)Bmp2的載體，比病毒載體或許更適合骨缺損修復(fù)。通過(guò)使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染骨形成基因可以上調(diào)成骨基因的表達(dá)，使得ADSCs在骨組織工程中的臨床應(yīng)用成為可能。