馬廣強 牛玲 宋瑩瑩 萬紅嬌 靳亮

閆成花（江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004）

常染色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種常見的單基因遺傳性腎病，主要由多囊腎病基因1（Pkd1）和多囊腎病基因2（Pkd2）基因突變所致。發(fā)病率為1/1 000~1/400，多見于成人，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞囊腫，腎實質(zhì)逐漸纖維化，腎功能進(jìn)行性減退，最終導(dǎo)致腎功能衰竭以及終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）［1］。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，中國約有150萬患者，多囊腎（polycystic kidney disease，PKD）是引起我國終末期腎病的四大病因之一［2］。ADPKD發(fā)病率高，預(yù)后差，受到社會的普遍關(guān)注和醫(yī)學(xué)界的高度重視?；颊咴谂R床中常伴有疼痛、血尿以及囊內(nèi)感染等并發(fā)癥，患者一生中可能經(jīng)歷數(shù)次囊內(nèi)感染，目前，西醫(yī)臨床對于PKD的治療無特異性藥物，主要通過藥物抑制囊腫增大及囊液分泌，以緩解臨床癥狀，延緩腎衰竭，若病情發(fā)展至終末期腎病，則以透析治療或換腎為主，近一半的ADPKD患者最終需要腎臟替代治療［3］。開發(fā)緩解或治療PKD的有效藥物是醫(yī)學(xué)界的一大難題，因此，研究PKD的發(fā)病機制，對探尋有效的治療方案具有重要作用。

中藥是我國乃至全球的寶貴財富，諸多中藥或者其提取物在各種疾病的治療上顯示了顯著的優(yōu)勢?？鄥ⅲ╯ophora flavescens ait）為豆科槐屬植物，是一種傳統(tǒng)中藥材，在我國已經(jīng)有兩千多年的使用歷史，主要具有清熱、利尿、殺蟲、祛濕等功效，同時還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等功能［4］?？鄥⒌纳锘钚猿煞种饕ㄉ飰A類和黃酮類成分，其中苦參堿在生物堿中含量相對較大，是最主要的活性物質(zhì)［5-7］?？鄥A具有抗病毒，抗腫瘤、抗菌以及抗炎等多方面作用［8］。但苦參堿對PKD疾病以及功能機制的研究尚無報道。本研究旨在探究苦參堿對腎上皮細(xì)胞自噬的影響及其調(diào)節(jié)機制，從而為臨床治療PKD患者提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料高糖培養(yǎng)基（索萊寶，12100）；DMSO（索萊寶，D8371）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（GEMINI，900-108）；胰酶（索萊寶，T1350）；IMCD3細(xì)胞（上海舜冉生物公司）；無菌PBS（索萊寶，P1020）；顯微鏡蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；苦參堿（湖南凱拉瑞生物科技有限公司，519-02-8）；0.22 μm無菌過濾器（碩華，621110）；BAF（Sigma，B1793）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（碩華，230101）；細(xì)胞培養(yǎng)板（碩華，220100）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天，C1062M-1）；CCK-8試劑盒（Bioss，BA00280）；TriQuick Reagent總RNA提取試劑（索萊寶，R1100）；2.5%戊二醛固定液（森倍伽生物科技，BL-G014）；4%多聚甲醛固定液（索萊寶，P1110）；LC3（Proteintech，14600-1-AP）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（索萊寶，P1200）；5×蛋白上樣緩沖液（索萊寶，P1040）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)IMCD3接種于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性實驗將胰酶消化后的IMCD3細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔細(xì)胞鋪板量為3×104個，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。分別用0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml的苦參堿處理，每個濃度2個復(fù)孔，并設(shè)置不加苦參堿的空白對照組，培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液20 μl以及180 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40 min。采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實驗將實驗分為：空白對照組；苦參堿處理組（0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml），每樣2個復(fù)孔。將貼壁細(xì)胞IMCD3以1.25×105個/孔，鋪板于12孔板中，培養(yǎng)24 h后給藥。將對照組和藥物處理組的IMCD3細(xì)胞使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色；將消化后的細(xì)胞懸液每樣取1×105個細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后加入1 μl碘化丙啶染色液，室溫（20~25℃）避光孵育10~20 min，隨后置于冰浴中，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡并計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 免疫熒光實驗將實驗分組為：空白對照組；苦參堿處理組（0.8 mg/ml），每樣2個復(fù)孔。將貼壁細(xì)胞IMCD3以2.5×105個/孔鋪板于6孔板中，孔內(nèi)預(yù)先放置無菌細(xì)胞爬片，加入細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后去掉原培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，按預(yù)先實驗設(shè)計給藥培養(yǎng)24 h。在達(dá)到上述培養(yǎng)條件后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基及苦參堿藥液，加入4%多聚甲醛固定液，固定20 min后去掉固定液。0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；過夜后加熒光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20~37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST洗4次，每次5 min洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5 透射電鏡樣品制備以及觀察實驗將實驗分為：空白對照組；苦參堿處理組（0.4 mg/ml、0.8 mg/ml）。將IMCD3細(xì)胞以2.5×105個/孔鋪板于6孔板中，加入含有10%FBS的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，按實驗設(shè)計去原培養(yǎng)基給予相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h；分別收集對照組和給藥組細(xì)胞于無酶EP管內(nèi)，加入2.5%戊二醛固定液，常溫固定5 min，5 000 r/min、4℃下離心2 min；去固定液后重新加入2.5%戊二醛固定液，挑起細(xì)胞沉淀至其懸浮；室溫避光固定30 min，轉(zhuǎn)移至4℃保存。后用鋨酸固定，乙醇逐級脫水、滲透，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鈾鉛染色，在透射電鏡下觀察并攝片。

1.2.6 Western blot法 檢 測LC3、Beclin-1、ERK、p-ERK、AKT、p-AKT、p-p70S6K、p70S6K、p53等蛋白的表達(dá)水平將實驗分為空白對照組；不同濃度苦參堿處理組。將對數(shù)生長期的IMCD3細(xì)胞以2.5×105個/孔加入6孔板中培養(yǎng)，24 h后去除原培養(yǎng)基用PBS清洗2遍后，按實驗分組設(shè)計分別給藥培養(yǎng)24 h。每孔加入500 μl配置好的細(xì)胞裂解液，用干凈的細(xì)胞刮刀刮取干凈并轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，每3 min渦旋振蕩15 s，反復(fù)5次使細(xì)胞充分裂解；振蕩完畢后，以12 000 r/min、4℃離心15 min。吸取上清至新的離心管，采用BCA法測量樣品蛋白濃度；測出濃度后將蛋白樣品稀釋至同一濃度，加入總體積1/5的5×上樣緩沖液，渦旋混勻后，金屬浴100℃加熱變性10 min，冷卻后于-30℃保存。使用SDS-PAGE試劑盒配置凝膠，將凝膠中的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA中室溫封閉2 h，加入對應(yīng)的一抗，4℃過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光液，用Alpha EaseFC凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像的掃描與采集。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析用GraphPad Prism 6進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，兩兩比較用獨立樣本的t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對IMCD3細(xì)胞活力的影響通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，不同濃度苦參堿（0.2、0.4、0.8 mg/ml）作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力無明顯變化，當(dāng)苦參堿濃度為1.6 mg/ml時，細(xì)胞活力受到明顯抑制（P<0.05），見圖1。

圖1 苦參堿對IMCD3細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of matrine on cell viability in IMCD3 cells

2.2 苦參堿對IMCD3細(xì)胞凋亡的影響通過流式細(xì)胞術(shù)檢測分析發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，當(dāng)苦參堿濃度為0.2、0.4、0.8 mg/ml時，細(xì)胞凋亡無明顯差異，當(dāng)苦參堿濃度為1.6 mg/ml時，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05），見圖2。

圖2 苦參堿對IMCD3細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of matrine on cell apoptosis in IMCD3 cells

2.3 苦參堿對IMCD3細(xì)胞自噬的影響通過Western blot檢測不同濃度苦參堿對細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，LC3蛋白表達(dá)明顯增強，見圖3A。此外，隨著處理時間增加，LC3蛋白的表達(dá)明顯增強，見圖3B。以上結(jié)果表明，苦參堿對細(xì)胞自噬的影響呈濃度和時間依賴性，雷帕霉素是一種經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑，將其作為陽性對照。發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加，0.8 mg/ml的苦參堿處理LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)也明顯增加，見圖3C。通過免疫熒光染色法檢測LC3蛋白的表達(dá)，空白對照組中，LC3紅色熒光較弱，且呈彌散狀態(tài)，0.8 mg/ml苦參堿處理組，細(xì)胞質(zhì)中LC3的染色強度明顯增強，見圖3D。透射電鏡分析進(jìn)一步證實，苦參堿處理后胞漿內(nèi)自噬小泡的數(shù)量明顯增多，且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性，見圖3E。3-methyladenine（3-MA）是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PI3K的抑制劑，可通過阻斷自噬早期自噬小泡的形成來抑制自噬。3-MA預(yù)處理可降低苦參堿處理組細(xì)胞中的LC3-Ⅱ表達(dá)，見圖3F。說明苦參堿可通過影響自噬小泡形成誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

圖3 苦參堿誘導(dǎo)IMCD3細(xì)胞自噬Fig.3 Matrine induced cell autophagy of IMCD3 cells

2.4 苦參堿影響IMCD3細(xì)胞自噬的機制不同濃度苦參堿（0.2、0.4、0.8 mg/ml）處理細(xì)胞24 h，隨著苦參堿濃度的增加，p-ERK和p-p70S6K的表達(dá)明顯降低，而Beclin-1、p53、ERK、p-AKT、AKT、p70S6K的表達(dá)未見明顯變化，見圖4。

圖4 Western blot檢測MAPK/mTOR信號通路蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of MAPK/mTOR signal pathway related proteins were tested by Western blot

3 討論

ADPKD以腎囊腫形成、炎癥和纖維化為主要特征。自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)損傷的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞的生物合成、營養(yǎng)和代謝及應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，可以維持細(xì)胞正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［9］，影響自噬的信號通路主要包括mTOR依賴的通路（PI3K/AKT/mTOR通路、AMPK/mTOR通路、MAPK/mTOR通路）和非mTOR依賴的通路。自噬與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如腫瘤，代謝失調(diào)等。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與PKD的發(fā)生也密切相關(guān)，自噬誘導(dǎo)劑可以緩解PKD的發(fā)生與發(fā)展。有報道PKD動物模型和PKD患者腎上皮細(xì)胞自噬反應(yīng)強度明顯減弱，表明自噬與PKD發(fā)生密切相關(guān)，在PKD發(fā)生過程中發(fā)揮重要功能［10-12］。腎上皮細(xì)胞初級纖毛對PKD具有保護(hù)作用，纖毛的存在是激活自噬所必需的，而自噬缺陷反過來又抑制纖毛的形成，從而促進(jìn)PKD的發(fā)生［13-14］。此外，治療PKD的試劑和藥物，如雷帕霉素和mTOR非依賴性藥物卡馬西平和米諾地爾，主要通過促進(jìn)腎上皮細(xì)胞自噬而發(fā)揮功能［15-16］。異常的mTOR激活與PKD中的自噬受損和纖毛缺陷有關(guān)［17］。因此，mTOR信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬可以保護(hù)腎功能，延緩PKD疾病的發(fā)生發(fā)展過程。本次研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以通過抑制MAPK/mTOR信號通路中ERK以及mTOR的磷酸化，誘導(dǎo)IMCD3自噬。

研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿是一種新型自噬誘導(dǎo)劑，在抗腫瘤方面具有重要功能?？鄥A可以通過下調(diào)STAT3抑制自噬，抑制線粒體能量的產(chǎn)生，從而抑制KRAS突變型胰腺癌MIAPACA2和8988T細(xì)胞的增殖［18］?？鄥A可誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡，但也可通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞保護(hù)性自噬［19］?？鄥A在急性髓系白血病中具有重要功能，可以通過抑制AKT、mTOR及其下游底物p70S6K和真核翻譯起始因子4 E結(jié)合蛋白1（eIF4EBP1）的磷酸化誘導(dǎo)自噬，抑制細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤活性［20］。YANG等［21］2015年發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以通過增加LC3-Ⅱ，Beclin-1和PI3KC3的表達(dá)水平，降低P62的表達(dá)水平來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞（HCC）自噬。2015年，XIE等［22］發(fā)現(xiàn)，苦參堿在不同的人肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的途徑不同，激活自噬相關(guān)信號通路不同，在SMMC7721細(xì)胞主要通過mTOR信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而在HepG2細(xì)胞中主要通過p53/AMPK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬?？鄥A抑制AKT和mTOR磷酸化，降低p62蛋白表達(dá)，促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)，通過AKT/mTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而具有抗乳腺癌活性［23］。但苦參堿在PKD中的功能及調(diào)控機制卻無報道。

本研究聚焦于自噬，主要探究苦參堿對小鼠腎臟內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞自噬的影響及機制。本次研究采用濃度為0.2、0.4、0.8 mg/ml的苦參堿處理IMCD3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，苦參堿不同濃度處理組IMCD3細(xì)胞的活性無變化，細(xì)胞的凋亡率也無明顯變化，表明苦參堿濃度≤0.8 mg/ml時，不影響細(xì)胞的活性和細(xì)胞的凋亡。但與空白對照組相比，細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)明顯升高，且苦參堿濃度梯度依賴性，表明苦參堿誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，苦參堿濃度增加，對細(xì)胞自噬誘導(dǎo)作用越強，這也進(jìn)一步說明苦參堿可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬參與PKD的治療。不同濃度的苦參堿（0.2、0.4、0.8 mg/ml）處理IMCD3細(xì)胞24 h后，與空白對照組相比，自噬相關(guān)信號通路蛋白ERK以及p70S6K的磷酸化明顯降低，苦參堿濃度越高，蛋白磷酸化水平越弱，說明苦參堿能夠有效抑制ERK以及p70S6K蛋白的功能，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬。

ADPKD的第一大特征囊腫形成，與腎間質(zhì)炎癥和纖維化密切相關(guān)，間質(zhì)炎癥可促進(jìn)腎組織纖維化，可導(dǎo)致囊腫擴(kuò)張，損傷腎功能［24］。腎間質(zhì)炎癥與囊腫液中多種炎癥性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等的表達(dá)和積累有關(guān)，囊液IL-6和TNF-α可誘導(dǎo)腎臟SMYD2表達(dá)，SMYD2轉(zhuǎn)錄靶基因Ptpn13，通過Ptpn13介導(dǎo)的磷酸化將SMYD2與其他PKD相關(guān)的信號通路相連，包括ERK、mTOR和AKT信號通路，促進(jìn)PKD囊腫生長［25］。巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中具有重要的功能，在人類PKD和動物模型中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤與囊腫形成密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）是ADPKD囊腫生長的重要調(diào)節(jié)因子，MIF通過激活ERK、mTOR和Rb/E2F通路，促進(jìn)囊性上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)囊腫形成［26］?？鄥A具有重要的抗炎作用，研究發(fā)現(xiàn)在香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道中性粒細(xì)胞炎癥模型中，苦參堿通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，減少氣道中性粒細(xì)胞炎癥［27］；苦參堿還可通過調(diào)節(jié)CCR7信號通路降低促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-17的表達(dá)，減輕脂多糖誘導(dǎo)的腸道炎癥和氧化應(yīng)激［28］；苦參堿通過抑制小鼠氣道上皮細(xì)胞NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)SOCS3表達(dá)，以劑量依賴性方式顯著抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠AHR、炎癥細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞分化和黏液生成。體外實驗表明，苦參堿可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α［29］?？鄥A能否發(fā)揮抑炎功能，通過抑制腎臟炎癥，緩解ADPKD的發(fā)生發(fā)展還有待深入研究。

綜上所述，苦參堿主要通過抑制MAPK/mTOR信號通路中ERK以及p70S6K的磷酸化起到促進(jìn)IMCD3細(xì)胞自噬的作用。下一步計劃在體內(nèi)探索苦參堿對PKD的影響，為PKD的新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。