韓光遠 劉可心 魏汝恒 苗珠月 馬存根 肖保國 黃建軍 宋麗娟

（山西中醫(yī)藥大學神經生物學研究中心/國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室，晉中 030619）

羥基紅花黃色素A對糖氧剝奪/復糖復氧后星形膠質細胞缺血性腦血管病嚴重危害人類健康，炎癥反應和氧化應激是其重要的病理生理過程。星形膠質細胞（astrocyte，Ast）作為中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中分布最廣、數(shù)量最多的細胞類型，在腦缺血缺氧后過度活化會引起膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）高表達，其在炎癥反應中的雙重作用備受關注：腦缺血后，反應性星形膠質細胞（reactive astrocytes，RAs）一方面通過產生抗炎細胞因子和形成膠質瘢痕等發(fā)揮保護作用，另一方面又可以通過釋放促炎因子和氧化應激損傷等進一步破壞腦組織［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，Ast在缺血性腦卒中炎癥反應中的雙重作用可能與其極化形成A1、A2兩種不同亞型密切相關［4］。另外，腦缺血再灌注過程中Ast氧化應激會產生大量的酶使氧化-抗氧化系統(tǒng)紊亂，從而導致細胞損傷［5］。

作為治療缺血性腦卒中的經典活血代表藥物紅花的有效單體成分羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA），其相對分子質量為612（分子結構式如圖1所示），具有抗缺血、抗炎、抗氧化及抗血栓的作用，對多種神經細胞都有保護功能［6-8］。但目前HSYA對糖氧剝奪/復糖復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）后Ast的作用鮮有報道。本研究利用原代Ast，觀察HSYA對OGD/R狀態(tài)下Ast的保護作用并探索其相關機制，為臨床應用活血化瘀藥有效防治缺血性腦卒中提供實驗依據(jù)，并試圖為臨床腦缺血的治療提供新的治療靶點。

圖1 HSYA的分子結構式Fig.1 Molecular structure of HSYA

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物C57BL/6小鼠，體質量16~18 g，購自北京斯貝福動物有限公司。動物實驗遵照山西中醫(yī)藥大學生物醫(yī)學研究倫理審查委員會制定的實驗動物倫理原則執(zhí)行科學實驗。動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.1.2 主要藥物與試劑HSYA（批號：4261）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；DMEM培養(yǎng)液、無糖型DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；胰酶、雙抗、MTT檢測試劑盒、LDH檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗C3抗體（ab200999）、抗S100A10抗體（ab76472）購自美國Abcam有限公司；抗PTX3抗體（D262383）購自上海生物工程有限公司；抗GFAP抗體（3670S）、抗p-NF-κB抗體（8242S）、抗p-STAT3抗體（9145S）購自美國Cell Signaling Technology公 司；HRP-羊 抗 兔 二 抗（BST15I16B15J55）、ALexa FluorTM488標記的山羊抗兔IgG二抗購自Thermo Fisher公司；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA檢測試劑盒購自Elabscience生物科技有限公司；CAT、SOD、GSH-Px、ROS、RNS、MDA檢測試劑盒購自上海泛柯實業(yè)有限公司。

1.1.3 主要儀器多用途低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；MCO175型CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；酶標儀購自美國Thermo公司；Bugbox M厭氧工作站購自英國Baker Ruskinn公司；熒光顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代Ast培養(yǎng)無菌條件下取新生1~3 d C57BL/6小鼠大腦皮質，在預冷的DMEM中剝離腦膜和血管，用吸管吹打形成單細胞懸液；4℃、1 500 r/min離心10 min。棄上清，加DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)吹打，過100目篩網，再次離心，1 500 r/min離心5 min。棄上清，加完全培養(yǎng)液重懸。接種于多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶中。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每3 d換液1次，直到細胞鋪滿整個瓶底，然后置于恒溫搖床，37℃、180 r/min離心18 h，以去除小膠質細胞和少突膠質細胞。2.5 g/L胰酶消化傳代。免疫熒光鑒定Ast純度≥95%用于實驗。

1.2.2 MTT檢測Ast活力將第二代Ast接種于96孔板中，待細胞生長融合至80%時，加入含終濃度為0、1、5、25、75、150 μmol/L HSYA的DMEM培養(yǎng)液，按上述實驗條件繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后小心吸棄上清，加入90 μl DMEM，再加入10 μl MTT，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。然后吸棄上清，加入110 μl Formanzan溶解液，搖床低速振蕩孵育10 min，使結晶全部溶解。酶標儀490 nm波長測定吸光度A值。細胞活力=（A樣本-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

1.2.3 LDH檢測HSYA對Ast的毒性（漏出率）將第二代Ast接種于96孔板中，待細胞生長至80%時，加入終濃度為0、1、5、25、75、150 μmol/L HSYA的DMEM培養(yǎng)液，按上述實驗條件繼續(xù)培養(yǎng)。取上清液檢測LDH活性。根據(jù)標準曲線和試劑盒測得LDH活性。

1.2.4 相關實驗分組及處理為探討HSYA對Ast的保護作用，實驗分為正常對照組（Normal）、模型組（OGD/R）和HSYA干預組（OGD/R+HSYA）。正常對照組在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，模型組在糖氧剝奪期間更換無糖DMEM培養(yǎng)液，放入95%N2、5%CO2的厭氧箱中孵育，4 h后更換為含糖DMEM培養(yǎng)液，然后放在常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。HSYA組在糖氧剝奪期間更換為含終濃度為75 μmol/L HSYA無糖培養(yǎng)液。

1.2.5 免疫熒光染色細胞爬片用4%多聚甲醛固定30 min，加入抗GFAP抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌，加入熒光二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌，加入DAPI染液避光孵育5 min，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察取圖像，Image-ProPlus6.0軟件分析結果。

1.2.6 RT-qPCR檢測按照RNA提取試劑盒說明書從細胞中提取總RNA。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA；逆轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s。特異性擴增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。按照2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR。反應體系（20 μl）：SYBR Premix EsTaq 10 μl，上下游引物各0.4 μl，ddH2O 7.2 μl，cDNA模板2 μl。擴增條件：預變性95℃30 s；變性95℃5 s，退火62℃30 s，延伸72℃30 s，重復45個循環(huán)。使用2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

表1 RT-qPCR引物種類及其序列Tab.1 RT-qPCR primer types and sequences

1.2.7 Western blot檢測提取各組蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。采用8%、10%凝膠SDS-PAGE電泳，濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，按比例稀釋，4℃過夜，TBST清洗后加入二抗37℃孵育2 h，TBST洗去二抗，加入顯影液。Bioanalytical Imaging System顯影。目的條帶采用Image J軟件進行圖像分析。

1.2.8 ELISA檢測收集培養(yǎng)細胞上清液，細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10測定采用相應的ELISA檢測試劑盒，氧化抗氧化指標CAT、SOD、GSH-Px、ROS、RNS、MDA采用相應的氧化損傷檢測試劑盒，具體操作方法按說明書推薦進行，參照各細胞因子標準曲線計算其含量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩兩比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HSYA對Ast活性的影響采用MTT和LDH檢測HSYA對Ast的活性和毒性影響。如圖2A所示，各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計后無顯著差異（P>0.05），表明Ast在正常培養(yǎng)條件下經不同濃度的HSYA處理后，并不影響細胞的活性和毒性，可根據(jù)后續(xù)實驗需要，選擇適當濃度。如圖2B所示，Ast在OGD/R條件下，HSYA終濃度為75 μmol/L時Ast活力處于最高峰；如圖2C所示，相比正常對照組，模型組在OGD/R后Ast的LDH釋放量明顯增多（P<0.01）；75 μmol/L HSYA作用于OGD/R后的Ast時LDH釋放量明顯少于模型組（P<0.05）。因此，本實驗選擇終濃度為75 μmol/L HSYA作為后續(xù)實驗藥物的最佳濃度。

圖2 MTT和LDH檢測HSYA對Ast藥物安全性Fig.2 MTT and LDH testing HSYA for Ast drug safety

在倒置相差顯微鏡下觀察，可見正常組Ast貼壁生長，呈星形或不規(guī)則形態(tài)，細胞與細胞之間緊密連接，透光度好；糖氧剝奪4 h，復糖復氧24 h后鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Ast數(shù)量減少，突觸回縮，細胞間緊密連接斷開，細胞腫脹變形，從形態(tài)學觀察可以看到氧糖剝奪對Ast有一定的損傷。75 μmol/L的HSYA可減輕OGD/R后Ast的損傷（圖3A）。

免疫熒光染色顯示，Ast的活化指標GFAP蛋白在正常組中表達較少（圖3B）。但在OGD/R損傷后，GFAP蛋白在模型組較正常組表達顯著增高，HSYA干預使GFAP蛋白的表達明顯低于模型組。免疫熒光統(tǒng)計分析顯示，模型組和HSYA干預組GFAP蛋白表達的平均熒光強度明顯高于正常組，但HSYA組較對照組顯著降低（圖3C，P<0.05）。Western blot檢測顯示，模型組和HSYA組Ast活化標志物GFAP蛋白表達明顯高于正常組，但HSYA組較對照組顯著降低（圖3D，P<0.05）。

圖3 HSYA對Ast活化的影響Fig.3 Effect of HSYA on activation of Ast

2.2 HSYA對OGD/R后Ast炎癥反應的影響在mRNA水平上，相較于正常對照組，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA水 平 均 顯 著升 高（P<0.05）；相較于模型組，HSYA干預使TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低（P<0.05），而顯著升高IL-10水平（P<0.05，圖4A）。ELISA結果表明，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白水平顯著高于正常對照組（P<0.05），HSYA干預組則明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，顯著增加IL-10水平（P<0.05，圖4B），與前述PCR實驗結果相一致。這表明OGD/R可刺激Ast釋 放 炎 癥 因 子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10，而HSYA可有效抑制Ast在OGD/R后促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，而增加抑炎因子IL-10的分泌。

圖4 HSYA對OGD/R后Ast炎癥因子的影響Fig.4 Effect of HSYA on Ast inflammatory factors after OGD/R

2.3 HSYA對OGD/R后Ast極化的影響首先采用RT-PCR檢測A1極化指標C3和A2極化指標S100A10以及PTX3 mRNA表達。結果顯示（圖5A），A1指標C3 mRNA水平模型組高于正常對照組（P<0.05），HSYA干預組低于模型組（P<0.05）。模型組A2極化指標S100A10和PTX3 mRNA水平均低于正常對照組（P<0.05），而HSYA干預組低于正常對照組，但高于模型組（P<0.05）。同樣，在蛋白水平上，Western blot檢測結果也表明（圖5B），相比于模型組，HSYA可顯著增加OGD/R后S100A10和PTX3的表達（P<0.05），降低C3的表達（P<0.05）。

圖5 HSYA對OGD/R后Ast極化的影響Fig.5 Effect of HSYA on polarization of Ast after OGD/R

2.4 HSYA對OGD/R后Ast p-NF-κB（p65）和p-STAT3蛋白水平的影響采用Western blot法檢測p-NF-κB（p65）和p-STAT3蛋白表達。結果顯示（圖6），模型組p-NF-κB（p65）和p-STAT3蛋白明顯高于正常組（P<0.05）；而HSYA干預組低于模型組（P<0.05）。

圖6 HSYA對OGD/R后Ast p-NF-κB（p65）和p-STAT3蛋白水平的影響Fig.6 Effect of HSYA on protein levels of Ast p-NF-κB（p65）and p-STAT3 after OGD/R

2.5 HSYA對OGD/R后Ast氧化應激作用的影響圖7顯示，模型組CAT、SOD、GSH-Px的含量均顯著降低，而RNS、ROS、MDA均顯著升高，且與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。經HSYA干預處理后，CAT、SOD、GSH-Px含量有所增加，RNS、ROS和MDA含量有所降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖7 HSYA對OGD/R后Ast氧化應激作用的影響Fig.7 Effect of HSYA on oxidative stress of Ast after OGD/R

2.6 HSYA對OGD/R后Ast Nrf2和HO-1蛋白 水 平的影響通過Western blot檢測氧化應激相關通路Nrf2/HO-1。結果顯示（圖8），模型組Nrf2和HO-1蛋白明顯低于正常組（P<0.05）；而HSYA干預組則高于模型組（P<0.05）。

圖8 HSYA對OGD/R后Ast Nrf2和HO-1蛋白水平的影響Fig.8 Effect of HSYA on protein levels of Ast Nrf2 and HO-1 after OGD/R

3 討論

腦缺血后，Ast被激活成為RAs。Ast在腦缺血缺氧進程中同時具有保護和損傷雙重作用［9］。這種雙重作用可能與RAs進一步極化形成兩種不同的亞型A1和A2密切相關。A1和A2動態(tài)調節(jié)免疫反應和炎癥微環(huán)境。A1促進相關損傷，C3被認為是A1的特征性標記；而A2發(fā)揮著保護作用，S100A10、PTX3被認為是A2的特征性標記［10］。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）作為腦缺血后炎癥反應中的關鍵轉錄因子［11］，在Ast的激活以及神經炎癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用［12］?；罨腘F-κB可通過調控炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產生促進炎癥反應。TSUBAKI等［13］和CAO等［14］的研究表明，抑制或阻斷NF-κB活化可下調細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6表達，減輕炎癥反應。另外，信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）也在腦缺血后Ast中表達并且活性發(fā)生改變［15］。IL-6的高表達可以促進STAT3持續(xù)磷酸化，IL-6/STAT3也是細胞內介導炎癥信號轉導的重要通路，其可介導促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和抑炎細胞因子IL-4、IL-10等多種炎癥因子的產生。Ast在腦缺血期間可通過NF-κB及STAT3通路來誘導炎癥細胞因子和神經毒性介質的釋放，導致神經元的損傷和死亡［16］。通過PCR以及Western blot技術檢測A1與A2的特異性標志和炎癥因子的表達，發(fā)現(xiàn)Ast在OGD/R后，C3被顯著誘導高表達，而S100A10、PTX3低表達，且炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌增加。這表明，Ast在OGD/R后確實存在著向A1極化的方向，并且促進了致炎因子的釋放。且在OGD/R時，A1的表達比A2更高。此外，還對影響Ast炎癥和極化的p-NF-κB（p65）以及p-STAT3也做了相應的研究，結果表明OGD/R可 以 上 調p-NF-κB（p65）以 及p-STAT3的表達。

目前，已有大量相關研究表明，HSYA具有抗缺血、抗炎和抗氧化等作用［17-18］。在體內腦缺血損傷模型中，HSYA可以增強腦缺血-再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)Ast的活性［19］。在體外模型中，HSYA還可以抑制OGD誘導的BV2小膠質細胞的炎癥反應［20］。在Aβ誘導的阿爾茨海默病模型中，HSYA可以抑制小膠質細胞和Ast的活化從而降低炎癥反應［21］。本研究發(fā)現(xiàn)HSYA干預能夠降低OGD/R損傷后Ast的活化，減少GFAP的表達并調節(jié)A1與A2的平衡。同時，經HSYA處理后，能夠減少促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌，增加IL-10分泌，從而減輕炎癥反應。HSYA還可以降低p-NF-κB（p65）以及p-STAT3的表達。表明HSYA可能是通過抑制p-NF-κB（p65）以及p-STAT3來調節(jié)腦缺血后Ast炎癥和極化。

同樣，HSYA也在抗氧化應激方面發(fā)揮了調節(jié)作用。田京偉等［22］在MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，HSYA對缺血腦細胞線粒體損傷有明顯的保護作用，能明顯降低腦缺血大鼠腦線粒體MDA含量，升高SOD活性。本研究表明HSYA同樣可以增加OGD/R損傷后Ast CAT、SOD、GSH-Px的活性，降低RNS、ROS、MDA含量，減輕OGD/R后Ast氧化應激導致的損傷。核因子E2相關因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是細胞內抗氧化應激功能的重要轉錄因子，也是防治腦缺血的重要潛在靶點［23］?；罨腘rf2可啟動下游信號HO-1，進而發(fā)揮抗氧化應激、清除自由基等作用［24-25］。劉瑩等［26］研究表明，青蒿琥酯通過Nrf2/HO-1信號通路增強了腦缺血后的抗氧化作用，能保護腦組織。周海燕等［27］研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸茨堿可能通過激活Nrf2/HO-1通路減輕局灶性腦缺血大鼠氧化應激損傷并緩解氧化-抗氧化失衡。由此可見，越來越多的研究表明，Nrf2/HO-1通路的激活可減輕腦缺血引起的氧化應激損傷。本研究表明，HSYA增加OGD/R后Nrf2/HO-1的表達，提示HSYA可能通過Nrf2/HO-1通路抑制腦缺血后氧化應激，減輕腦損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HSYA可以降低Ast活化，抑制炎癥因子的釋放并影響極化水平，這可能是通過抑制p-NF-κB（p65）與p-STAT3通路實現(xiàn)的；同時，HSYA也可能通過Nrf2/HO-1通路減輕缺血后氧化應激損傷，表明HSYA可能在腦缺血后Ast中起著復雜的多重作用；即HSYA對OGD/R后Ast一方面能夠減輕炎癥反應并調節(jié)A1與A2的表型，另一方面發(fā)揮抗氧化作用降低氧化損傷，共同減輕缺血性損害，這為HSYA治療神經系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。但本研究只在細胞模型上做了研究，在動物體內還存在著各種復雜的反應機制，HSYA在動物體內是否具有同樣的保護作用，還需要進一步研究證實。