鞠文媛 陳陽陽 褚果果 李曉慧 張海飛 宋麗娟 王青 尉杰忠 肖保國 馬存根

（山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室，晉中 030619）

星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中最大的膠質(zhì)細(xì)胞群體，中樞一旦受損，星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，修復(fù)受損組織，恢復(fù)神經(jīng)功能［1］。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為血腦屏障后的第一類實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是抵抗外源性氧化損傷的第一道防線，有其自身的抗氧化防御系統(tǒng)。高活性的抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（glutathi?one peroxidase，GSH-Px）、過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）和超氧化 物 歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1

（nuclear factor erythroid-2-related factor 2/heme oxy?genase 1，Nrf2/HO-1）抗氧化通路等共同抵抗氧化損傷［2］。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）變性疾病中，持續(xù)的致病因素的刺激，使得星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化體系失控，造成氧化產(chǎn)物釋放增多，抗氧化酶的表達(dá)降低［3］。所以在該類疾病中，調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化體系，對(duì)于治療疾病是一種重要的策略。

白果內(nèi)酯（bilobalide，BB）是從銀杏葉中提取出的一種倍半萜內(nèi)酯，本課題組既往的研究顯示其可緩解雙環(huán)己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）誘導(dǎo)的髓鞘脫失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BB對(duì)CPZ模型病灶區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)有明顯的影響，但是否有抗氧化機(jī)制參與并不清楚［4］。另外，有報(bào)道在缺血/再灌注模型中，BB可通過對(duì)抗缺血/再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5］?；谘趸瘧?yīng)激在髓鞘脫失中的重要作用，本研究初步探索了BB對(duì)CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響和作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物10~12周齡的C57BL/6雄性小鼠共24只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物在清潔級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑與儀器BB（中國南京道斯夫生物科技有限公司）；CPZ（美國Sigma公司）；脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）（中國北京索萊寶科技有限公司）；氧化和抗氧化試劑盒（中國上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司）；抗體如anti-GFAP（美國Abcam）；anti-Nrf2（美國Cell signaling technology）；anti-HO-1（中國愛必信）；DAPI溶液（中國北京索萊寶科技有限公司）；TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國Jackson immunoResearch）；Alex Flour 488標(biāo)記的驢抗雞IgG二抗（美國Jackson immunoResearch）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（中國武漢博士德生物工程有限公司）；熒光顯微鏡（美國Leica）；冷凍切片機(jī)（德國Leica）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥24只小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組和BB治療組，每組8只。在飼料粉末中混入0.2%的CPZ制成CPZ飼料。模型組和BB治療組每天喂食CPZ飼料，正常組喂養(yǎng)正常飼料，共6周。BB治療組從喂食CPZ飼料的第4周末開始，每天腹腔注射BB 40 mg/（kg·d）1次，200 μl/只，持續(xù)給藥到第6周末，共2周。正常對(duì)照組和模型組每天持續(xù)腹腔注射等量的生理鹽水2周。

1.2.2 組織制備小鼠用10%水合氯醛麻醉完全后，解剖胸部，暴露心臟，每組隨機(jī)選取4只，用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注后，再用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，固定完全后取出完整的腦組織，4%多聚甲醛4℃固定2 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋腦組織，制成10 μm的冷凍切片，用于組織的免疫熒光染色。每組中剩下的4只，用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注后，冰上取出腦組織，置于玻璃研磨器中，并按照每20 mg組織加入150 μl的比例加入組織裂解液進(jìn)行研磨，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，即為各組腦蛋白提取液，-80℃冰箱保存。

1.2.3 盧卡斯快藍(lán)染色檢測(cè)胼胝體區(qū)域髓鞘脫失情況將腦切片放入提前配好的固藍(lán)染液中，56℃浸泡過夜。次日，95%乙醇和去離子水洗滌，以去除多余的固藍(lán)染液，碳酸鋰溶液、75%乙醇溶液和去離子水中反復(fù)浸洗，直到能夠明顯區(qū)分灰質(zhì)和白質(zhì)。最后，置于梯度乙醇溶液中進(jìn)行脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并收集圖片，Image-ProPlus6.0計(jì)算胼胝體區(qū)域的累積光密度。

1.2.4 免疫熒光染色檢測(cè)腦組織中Nrf2和HO-1的表達(dá)腦組織切片從-80℃冰箱取出，室溫中靜置片刻，置于4%多聚甲醛固定20 min。PBS淋洗，1%BSA封 閉1 h，加入 一 抗anti-GFAP、anti-Nrf2、anti-HO-1，4℃冰箱過夜。次日，PBS淋洗后，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，PBS淋洗，加入DAPI溶液染10 min，PBS淋洗，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，Image-ProPlus6.0軟件分析結(jié)果。

1.2.5 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的制備新生的C57BL/6小鼠（24 h內(nèi)出生）若干，75%的乙醇消毒皮膚，無菌超凈臺(tái)中斷頭，分離出大腦皮層，放于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，用吸管反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液。4℃、3 000 r/min離心10 min，棄掉上清，細(xì)胞沉淀重懸于DMEM完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）中，濾網(wǎng)過濾后，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，置于75 cm2培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第7天，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%時(shí)，置于搖床上，180 r/min持續(xù)搖晃12 h，去除小膠質(zhì)細(xì)胞，以達(dá)到純化星形膠質(zhì)細(xì)胞的目的。以上過程重復(fù)2~3次。

1.2.6 氧化和抗氧化指標(biāo)檢測(cè)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。各組腦蛋白提取液，用BCA法定量至相同的蛋白濃度。參照氧化和抗氧化試劑盒說明書檢測(cè)相關(guān)氧化指標(biāo)如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和抗氧化指標(biāo)如CAT、GSH-Px和SOD水平。

1.2.7 Western blot檢測(cè)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2和HO-1的表達(dá)各組細(xì)胞蛋白提取液，按每40 μl的蛋白樣本加入10 μl的5×loading Buffer后，沸水煮10 min。根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)的蛋白分子量制膠，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，用TBST稀釋一抗Nrf2（1∶500）和HO-1（1∶300），加入到PVDF膜上，4℃過夜。次日，TBST洗去膜上多余的一抗，加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗，加入ECL顯色液進(jìn)行顯色、拍照。Image J計(jì)算每組的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Graph Pad8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較選用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BB改善了CPZ小鼠的行為學(xué)和髓鞘脫失對(duì)小鼠進(jìn)行高架十字迷宮和T迷宮測(cè)試，以檢測(cè)小鼠的焦慮狀態(tài)和學(xué)習(xí)能力。如圖1所示，高架十字迷宮結(jié)果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)減少（P<0.001）。與CPZ組相比，BB治療組小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)增多（P<0.05）。T迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠在食物臂的運(yùn)動(dòng)距離明顯縮短（P<0.001）。與CPZ組相比，BB治療組小鼠在食物臂的運(yùn)動(dòng)距離增長(zhǎng)（P<0.05）。以上結(jié)果表明，BB用藥后改善了小鼠的焦慮情緒，提高了學(xué)習(xí)能力。盧卡斯快藍(lán)染色結(jié)果顯示，與正常組相比，CPZ組胼胝體區(qū)域的髓鞘脫失嚴(yán)重（P<0.01），與CPZ組相比，BB用藥組減輕了胼胝體區(qū)域的髓鞘脫失（P<0.01）。

圖1 各組小鼠的行為學(xué)測(cè)試和病理學(xué)染色（×50）Fig.1 Behavioral test and pathological staining of mice in each group（×50）

2.2 BB抑制CPZ小鼠氧化應(yīng)激如圖2所示，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，CPZ組腦組織中ROS、RNS和MDA等氧化產(chǎn)物的含量增加（P<0.01或P<0.05）；CAT、GSH-Px和SOD等抗氧化酶的含量減少（P<0.01或P<0.001）。與CPZ組相比，BB干預(yù)后顯著下調(diào)了小鼠腦組織中氧化產(chǎn)物ROS、RNS和MDA水平（P<0.05），上調(diào)了抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD水平（P<0.05）。

圖2 BB對(duì)CPZ小鼠氧化應(yīng)激的影響Fig.2 Effects of BB on oxidative stress in CPZ mice

2.3 BB激活CPZ小鼠Nrf2/HO-1信號(hào)通路為探究星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與CPZ小鼠腦內(nèi)的抗氧化過程，小鼠腦片的星形膠質(zhì)細(xì)胞和Nrf2/HO-1抗氧化通路進(jìn)行免疫熒光染色。如圖3所示，與正常組相比，CPZ組小鼠腦內(nèi)GFAP+Nrf2+/HO-1+的細(xì)胞表達(dá)增多，并出現(xiàn)Nrf2核轉(zhuǎn)移的情況（P<0.01或P<0.001），表明在氧化應(yīng)激下，激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路。與CPZ組相比，BB用藥組小鼠腦內(nèi)GFAP+Nrf2+/HO-1+細(xì)胞表達(dá)進(jìn)一步增多，并且出現(xiàn)Nrf2核轉(zhuǎn)移的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多（P<0.01），表明BB治療后可進(jìn)一步激活腦內(nèi)Nrf2/HO-1抗氧化通路，并且星形膠質(zhì)細(xì)胞參與到CPZ小鼠體內(nèi)的抗氧化過程。

圖3 BB對(duì)CPZ小鼠Nrf2/HO-1通路的影響（×100）Fig.3 Effect of BB on Nrf2/HO-1 pathway in CPZ mice（×100）

2.4 BB抑制LPS刺激的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激如圖4所示，與正常組相比，LPS組的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的ROS、RNS和MDA氧化產(chǎn)物增多（P<0.01或P<0.001），分泌的CAT、GSH-Px和SOD抗氧化酶減少（P<0.01或P<0.001）。與LPS組相比，BB用藥組顯著下調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的ROS、RNS和MDA水平（P<0.05或P<0.01），上調(diào)了原代星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD水平（P<0.05）。

圖4 BB對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.4 Effect of BB on oxidative stress of primary astrocytes

2.5 BB增加LPS刺激的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)如圖5所示，與正常組相比，LPS組中原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2/HO-1的表達(dá)增加（P<0.05）；與LPS組相比，BB用藥組中原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01或P<0.001）。

圖5 各組原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)Fig.5 Expressions of Nrf2 and HO-1 protein in primary astrocytes of each group

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了BB具有良好的抗氧化作用，可以通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解髓鞘脫失。在CPZ小鼠模型中，BB可抑制腦組織中ROS、RNS和MDA氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，上調(diào)抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD的水平，并且激活腦內(nèi)的Nrf2/HO-1抗氧化通路。在星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外模型中，BB用藥后抑制了氧化產(chǎn)物ROS、RNS和MDA的產(chǎn)生，增加抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD的表達(dá)，并且促進(jìn)了原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，表明BB的抗氧化作用可能與其促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常活化是多發(fā)性硬化（multiple slerosis，MS）等CNS炎癥變性疾病的主要病理標(biāo)志之一［6］。在該類疾病中，大多都存在星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙和抗氧化系統(tǒng)的紊亂，造成神經(jīng)元死亡等，這可能是其重要的發(fā)病機(jī)制［7-8］。所以，靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞成為當(dāng)前治療CNS炎癥變性疾病的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，本課題組重點(diǎn)關(guān)注了星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，通過減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷，達(dá)到了保護(hù)髓鞘的目的。BB是從銀杏葉中提取出的一種安全有效的活性單體［9］，文獻(xiàn)報(bào)道了BB對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用［10-11］。另外，文獻(xiàn)對(duì)BB是否能夠通過血腦屏障進(jìn)行了論述，在體外實(shí)驗(yàn)中使用血腦屏障滲透率的模型檢測(cè)了BB的血腦屏障透過率，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用大鼠模型評(píng)估了BB的腦內(nèi)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BB可以較好地通過血腦屏障［12］。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，BB具有很好的抗氧化的作用，但是沒有關(guān)于BB在靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞緩解髓鞘脫失方面的研究。

氧化損傷在多種CNS疾病中起關(guān)鍵作用［13］。ROS和RNS的過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡［14］，研究發(fā)現(xiàn)在MS等疾病患者的腦內(nèi)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS等氧化產(chǎn)物增多，與膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨蜕窠?jīng)元損傷有很大的關(guān)系［15-16］。因此，減輕氧化應(yīng)激是治療和預(yù)防MS等神經(jīng)炎癥變性疾病的潛在策略。在機(jī)體的抗氧化防御體系中，CAT、GSH-Px和SOD是最常見的抗氧化酶，也是清除ROS、RNS和MDA等氧化產(chǎn)物的重要指標(biāo)［17］。SOD是活性氧損傷的第一道防線，可降低過高濃度的活性氧物質(zhì)，并把他們分解為危害較小的過氧化氫和水，保護(hù)細(xì)胞免受損傷［18］。CAT則通過將過氧化氫分解水和氧分子，進(jìn)一步對(duì)抗氧化損傷［19］。GSH-Px是一種體內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激過程中重要的過氧化物分解酶，通過把有毒的氧化產(chǎn)物谷胱甘肽催化為無毒的氧化型谷胱甘肽，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化物的損傷［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，BB可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中這些抗氧化酶的表達(dá)，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1抗氧化通路有關(guān)?？寡趸男盘?hào)通路有很多種，Nrf2/HO-1信號(hào)通路是其中一條重要的通路［21］。Nrf2是抗氧化反應(yīng)中不可或缺的調(diào)控因子，在正常情況下，其活性被抑制，kelch樣ech相關(guān)蛋白1（kelch-like ech-associated protein 1，Keap1）與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，這時(shí)Nrf2是處于未激活狀態(tài)；如果一直未激活，Nrf2會(huì)被泛素化進(jìn)而被降解；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2被激活。Nrf2從Keap1中釋放，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活下游抗氧化基因的表達(dá)，包括HO-1以及抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD［22-23］。本次研究表明，BB干預(yù)促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)Nrf2下 游 基 因HO-1及 抗 氧 化 酶CAT、GSH-Px和SOD的表達(dá)。研究顯示，通過上調(diào)Nrf2和HO-1的表達(dá)來保護(hù)細(xì)胞損傷，對(duì)MS等疾病都有神經(jīng)保護(hù)作用［24］。在臨床上，靶向Nrf2的藥物富馬酸二甲酯是治療進(jìn)展型MS的高效藥物，與其可以透過血腦屏障、減少炎癥細(xì)胞遷移、減少細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)，從而可降低患者的復(fù)發(fā)率［25］。而BB對(duì)星形細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路的作用，為其治療MS等脫髓鞘疾病提供了新的理論支持。

大量實(shí)驗(yàn)研究提示氧化應(yīng)激和脫髓鞘之間存在某種因果關(guān)系［25-27］。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致CPZ模型中發(fā)生脫髓鞘病變的主要原因之一。氧化應(yīng)激可產(chǎn)生過多的氧自由基及其代謝產(chǎn)物，引發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)和線粒體損傷，導(dǎo)致髓鞘脫失。在疾病的早期階段，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦內(nèi)脫髓鞘的主要病因，而隨著病情的發(fā)展，體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的紊亂，使得體內(nèi)氧化應(yīng)激和脫髓鞘病變互為因果，使得病情進(jìn)一步加重［28］。本課題組利用CPZ誘導(dǎo)的中樞脫髓鞘模型，發(fā)現(xiàn)BB干預(yù)可有效保護(hù)髓鞘脫失，誘導(dǎo)Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而增加抗氧化產(chǎn)物形成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，推測(cè)可能與髓鞘保護(hù)有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，利用體外原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，驗(yàn)證了BB干預(yù)可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)分子表達(dá)，從而增加抗氧化產(chǎn)物形成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)?；谇叭搜芯亢捅疚牡慕Y(jié)果，本課題組推測(cè)BB干預(yù)緩解髓鞘脫失，可能與促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路，產(chǎn)生抗氧化產(chǎn)物，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。但鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激與脫髓鞘之間的重要關(guān)系，下一步將進(jìn)行深入的探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，BB可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路發(fā)揮髓鞘保護(hù)作用，為下一步深入的研究奠定了基礎(chǔ)。