楊雷 伍搏宇 熊輝齊 新宇 簡功輝 楊少鋒 聶穎 馬露

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)破壞、骨質(zhì)增生和關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)樘卣鞯穆约膊?。目前機(jī)制尚不清楚，多種因素均可導(dǎo)致OA［1-3］。既往認(rèn)為OA是一種“磨損”疾病，而目前卻認(rèn)為OA是一種免疫相關(guān)疾病，免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補(bǔ)體激活、破骨細(xì)胞激活以及細(xì)胞因子平衡失調(diào)在OA病情進(jìn)展中處于重要地位，備受關(guān)注［4-5］。早期OA患者影像學(xué)改變并不明顯，而滑膜炎卻是所有關(guān)節(jié)炎最早出現(xiàn)的共有特征［6］。滑膜組織作為OA免疫系統(tǒng)的損傷對(duì)象，是持續(xù)性關(guān)節(jié)退行性變的主要驅(qū)動(dòng)因素，尤其免疫細(xì)胞浸潤，包括漿細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞滑膜浸潤參與并介導(dǎo)了OA的自身免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子、趨化因子及蛋白酶分泌，擾亂免疫平衡進(jìn)而加速軟骨和骨侵蝕，在OA發(fā)生發(fā)展、惡化過程中起重要作用［7-10］。因此，從免疫浸潤角度研究OA發(fā)病機(jī)制是針對(duì)OA早期治療、防止惡化的先決條件，可為OA精準(zhǔn)靶向免疫治療提供新途徑。

生物信息學(xué)是分子生物學(xué)和信息技術(shù)的新興交叉學(xué)科，可揭示疾病分子機(jī)制?；蛐酒鳛橐环N新興技術(shù)，已被用于生物信息的高效、大規(guī)模獲取，可廣泛收集疾病表達(dá)譜數(shù)據(jù)，尤其對(duì)多種免疫細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)研究具有指導(dǎo)作用。本文采用生物信息學(xué)工具對(duì)通用基因芯片數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中OA患者和正常人群滑膜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過CIBERSORT反卷積算法分析OA滑膜中的免疫浸潤情況，并根據(jù)差異的免疫浸潤基因預(yù)測相關(guān)免疫調(diào)節(jié)中藥，為OA免疫機(jī)制研究和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)中藥篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)采用GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫搜索OA滑膜基因芯片數(shù)據(jù)，篩選GSE55235數(shù)據(jù)，由Thomas H?upl提供（包含10個(gè)正常人群滑膜組織、10個(gè)OA患者滑膜組織），設(shè)正常滑膜為對(duì)照組，OA患者滑膜數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)GPL96-57554（［HG-U133A］Affymetrix Human Genome U133A Array）平臺(tái)將探針轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.2 差異表達(dá)基因獲取通過R語言程序“l(fā)imma”安裝包對(duì)基因探針進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)，并根據(jù)篩選條件|log2FC|≥1和校正P<0.05進(jìn)行差異基因分析，其中l(wèi)og2FC<0代表基因表達(dá)下調(diào)，log2FC>0代表基因表達(dá)上調(diào)。

1.3 核心基因獲取和注釋將兩組差異基因通過在線平臺(tái)STRING（www.string-db.org/cgi/input.pl）獲取蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，采用Cytoscape插件工具cyto Hubba中的MCC方法識(shí)別重要基因，將重要基因進(jìn)行可視化，并列出排名前10的作為核心基因。采用R語言cluster Profiler對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論（genetic ontology，GO）分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并探究其潛在生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及重要信號(hào)通路。

1.4 免疫細(xì)胞浸潤矩陣獲取采用R語言程序并鏈接CIBERSORT反卷積算法進(jìn)行活化記憶性CD4 T細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等22種免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征的模擬計(jì)算［11］。為了結(jié)果準(zhǔn)確，設(shè)定模擬次數(shù)為1 000次，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)P<0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 免疫細(xì)胞相關(guān)性和差異分析為分析各類免疫細(xì)胞相關(guān)性，對(duì)CIBERSORT反卷積算法以P<0.05基礎(chǔ)上篩選的可信樣本數(shù)據(jù)中進(jìn)行不同免疫細(xì)胞間Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算，并采用秩和檢驗(yàn)比較OA組與對(duì)照組差異。

1.6 OA免疫浸潤過程潛在中藥預(yù)測將兩組差異的核心靶基因和GO富集與免疫相關(guān)BP導(dǎo)入在線平臺(tái)（www.coremine.com/medical/），篩選具有潛在免疫調(diào)節(jié)作用的藥物，采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并對(duì)中藥進(jìn)行功效、歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)。

1.7 主要觀察指標(biāo)通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取正常人群滑膜和OA患者滑膜組織差異基因及免疫細(xì)胞浸潤分布，并進(jìn)行潛在中藥預(yù)測，主要觀察指標(biāo)：①正?；そM織和OA滑膜組織免疫細(xì)胞浸潤的分布差異及相關(guān)性；②正?；そM織和OA滑膜組織差異的靶基因；③OA滑膜組織免疫浸潤相關(guān)BP和可能信號(hào)通路；④挖掘調(diào)節(jié)OA滑膜組織局部免疫微環(huán)境的潛在治療中藥。

2 結(jié)果

2.1 OA患者差異表達(dá)基因結(jié)果對(duì)來自GSE55235的微陣列進(jìn)行篩選，共得到10個(gè)健康志愿者和10個(gè)OA患者滑膜組織芯片，正?；そM織和OA滑膜組織差異基因共716個(gè)，其中上調(diào)基因382個(gè)，下調(diào)基因334個(gè)（圖1）。

圖1 OA滑膜組織基因芯片差異表達(dá)基因熱圖和火山圖Fig.1 Heat map and volcano map of OA synovium-related differential expression genes

2.2 核心靶基因獲取結(jié)果將716個(gè)差異表達(dá)基因?qū)隨TRING繪制PPI，并將分析結(jié)果的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化展示（圖2），經(jīng)cyto Hubba計(jì)算列取前10位作為核心基因，分別為IL-6、CXCL8、JUN、VEGFA、IL-1β、MMP9、ITGB2、FOS、APOB、CXCL12（表1）。

表1 PPI模型中OA組和正常組差異核心靶基因Tab.1 Core differential target genes in PPI networks of OA and normal groups

圖2 OA滑膜組織差異基因PPI及核心蛋白基因模塊Fig.2 OA synovium tissue differential gene PPI networks map and Hub genes

2.3 差異基因GO和KEGG富集分析采用R軟件cluster Profiler對(duì)OA差異基因進(jìn)行BP和KEGG分析，上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為382、334個(gè)，GO分析得到BP 374、879條，上調(diào)基因共富集到34條通路，下調(diào)基因共富集到39條通路，對(duì)比上調(diào)基因和下調(diào)基因GO和KEGG富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因與免疫密切相關(guān)，GO主要涉及白細(xì)胞正向調(diào)節(jié)、吞噬作用、T細(xì)胞呈遞激活等BP（圖3A）。KEGG富集的相關(guān)通路主要涉及吞噬小體、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路（圖3B），而下調(diào)基因GO主要涉及對(duì)氧水平的反應(yīng)、對(duì)氧水平下降的反應(yīng)、節(jié)律過程等非免疫BP（圖3C），相關(guān)信號(hào)通路主要涉及毒性心肌炎相關(guān)通路、利什曼病相關(guān)信號(hào)通路等轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（圖3D）。

圖3 OA差異基因GO及KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of differential genes related to OA

2.4 免疫浸潤細(xì)胞分布采用CIBERSORT反卷積法以P<0.05為篩選條件對(duì)芯片進(jìn)行篩選，共得到20個(gè)可信樣本，熱圖左側(cè)10個(gè)為正?；そM織，右側(cè)10個(gè)為OA滑膜組，未活化的記憶CD4 T細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞含量在OA滑膜組織中不同程度減少，而M0型巨噬細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞含量在OA滑膜中均出現(xiàn)不同程度增加（圖4A），圖4B進(jìn)一步展示了22種免疫細(xì)胞在各樣本中的含量分布。

圖4 正常人群和OA患者免疫細(xì)胞浸潤分布Fig.4 Infiltration of immune-associated cells in normal and OA samples

2.5 免疫細(xì)胞相關(guān)性及差異分析未活化的CD4記憶T細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞（r=0.66）、未活化的樹突狀細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞（r=0.54）、M1型巨噬細(xì)胞和活化的CD4記憶T細(xì)胞（r=0.49）呈正相關(guān)；而未活化的肥大細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞（r=-0.78）、記憶B細(xì)胞和活化的B細(xì)胞（r=-0.67）、未活化的CD4記憶T細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞（r=-0.62）呈負(fù)相關(guān)（圖5A）。通過小提琴圖較為直觀地展現(xiàn)正常人群和OA患者滑膜組織免疫浸潤細(xì)胞差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，漿細(xì)胞（P=0.019）、M0型巨噬細(xì)胞（P=0.038）和未活化的肥大細(xì)胞（P<0.001）在OA滑膜組織中含量較高，而未活化的CD4記憶T細(xì)胞（P<0.001）、活化的NK細(xì)胞（P=0.026）、活化的肥大細(xì)胞（P<0.001）在OA滑膜組織中均出現(xiàn)不同程度降低（圖5B）。

圖5 OA組織中免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)性及差異小提琴圖Fig.5 Correlation analysis and violin plot of differences of immune cells in OA group

2.6 干預(yù)OA滑膜組織免疫浸潤機(jī)制的中藥挖掘通過Coremine Medical預(yù)測和挖掘潛在干預(yù)OA免疫浸潤的中藥，以P<0.01作為篩選條件，共得到123味中藥，與白細(xì)胞黏附、白細(xì)胞增殖、吞噬作用、抗原呈遞與表達(dá)、T細(xì)胞呈遞等BP及IL-6、CXCL8、JUN、VEGFA、IL-1β、MMP9等核心靶基因密切相關(guān)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析，共得到節(jié)點(diǎn)137個(gè)，邊226條，青風(fēng)藤、姜黃、雷公藤、藤黃等度值較高，提示與OA免疫浸潤機(jī)制密切相關(guān)，將這些中藥進(jìn)行歸經(jīng)，功效分析顯示OA免疫浸潤相關(guān)藥物均歸屬肝、腎、肺經(jīng)，藥物功效以清熱類、補(bǔ)虛類、祛風(fēng)濕類、活血化瘀類、解表類等為主，提示以上藥物可能作為OA免疫治療的潛在候選中藥（圖6）。

圖6 OA免疫浸潤機(jī)制潛在中藥功效及雷達(dá)圖Fig.6 Potential traditional Chinese medicine efficacy map and radar map of osteoarthritis immune infiltra?tion mechanism

3 討論

滑膜組織是OA免疫系統(tǒng)的主要入侵對(duì)象，本研究將正常人群和OA患者滑膜組織差異基因進(jìn)行PPI分析，篩選出10個(gè)與OA免疫相關(guān)的核心靶基因IL-6、CXCL8、JUN、VEGFA、IL-1β、MMP9、ITGβ2、FOS、APOB、CXCL12，除ITGβ2和APOB基因未見報(bào)道以外，其他均發(fā)現(xiàn)參與OA滑膜免疫浸潤過程。VEGFA可介導(dǎo)早期OA滑膜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤誘導(dǎo)血管炎癥［12］；JUN和FOS在OA滑膜中高表達(dá)，參與炎癥細(xì)胞彌散浸潤［13］；MMP9參與CD4+T細(xì)胞調(diào)控巨噬細(xì)胞浸滑膜病程；IL在OA患者滑膜組織中主要由白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜纖維細(xì)胞等產(chǎn)生［14］，OA患者滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中均不同程度增高［15］；此外，過多IL產(chǎn)生可抑制軟骨中Ⅱ型膠原生成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶類產(chǎn)生，加速軟骨侵蝕［16］。本研究預(yù)測出的IL-6、IL-1β在OA進(jìn)程中備受關(guān)注，已展開大量相關(guān)研究［17-18］。而趨化因子（CXCL）是一類具有化學(xué)趨化作用的細(xì)胞因子，主要由滑膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，且與血管炎發(fā)展密切相關(guān)，介導(dǎo)早期OA出現(xiàn)滑膜炎癥［19］。CXCL8可影響JAK-STAT、NF-κB和JNK-MAPK信號(hào)通路并增強(qiáng)其他促炎細(xì)胞因子表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制軟骨細(xì)胞增殖［20］；CXCL12可驅(qū)動(dòng)樹突狀細(xì)胞從血液募集至發(fā)生炎癥反應(yīng)的滑膜誘導(dǎo)OA慢性炎癥［21］。本研究篩選出的大部分核心靶基因與目前OA免疫相關(guān)研究結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)研究結(jié)果的可靠性。對(duì)OA滑膜組織差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示上調(diào)基因與OA免疫機(jī)制密切相關(guān)，主要涉及多種免疫細(xì)胞，進(jìn)一步說明OA是由多種炎癥細(xì)胞及因子共同參與的免疫過程，存在錯(cuò)綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而KEGG富集預(yù)測出大部分信號(hào)通路均介導(dǎo)了OA免疫過程，這些通路在誘導(dǎo)OA滑膜炎癥因子滲出、免疫細(xì)胞浸潤、補(bǔ)體系統(tǒng)激活、體液免疫和細(xì)胞免疫過程中均發(fā)揮重要作用［22］。

為深入研究免疫細(xì)胞在OA滑膜組織的作用，采用CIBERSORT反卷積法對(duì)兩組免疫相關(guān)差異基因進(jìn)行篩選，CIBERSORT反卷積算法是基于線性支持向量回歸（SVR）的可靠機(jī)器學(xué)習(xí)方法，廣泛用于評(píng)估22種免疫細(xì)胞相對(duì)含量及動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過程，在噪聲、未知混合物含量和密切相關(guān)的細(xì)胞類型方面優(yōu)于其他方法。最終結(jié)果顯示漿細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞和未活化的肥大細(xì)胞在OA滑膜組織中含量較高，而未活化的CD4記憶T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞在OA滑膜組織不同程度降低，以上研究結(jié)果部分得到相關(guān)基礎(chǔ)研究證實(shí)，如OA滑膜組織中肥大細(xì)胞浸潤程度較高，與OA患者結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，其機(jī)制可能與肥大細(xì)胞釋放大量TNF-α及IL-6等細(xì)胞因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，刺激滑膜增生和軟骨侵蝕［23］；記憶CD4+T細(xì)胞積累是關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)過程中的常見現(xiàn)象，可能與慢性O(shè)A形成有關(guān)［24］；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在OA滑膜中含量豐富，其水平與炎癥因子水平相關(guān)［25］；而滑液中過量的CD19+CD24hiC7+B細(xì)胞可加速軟骨破壞［26］；M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子與產(chǎn)生抗炎因子的M2型巨噬細(xì)胞比例失衡是促進(jìn)OA進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制之一，調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞有望對(duì)延緩OA起積極治療作用［27-28］。上述文獻(xiàn)證據(jù)結(jié)合課題組分析結(jié)果表明巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞等在OA中發(fā)揮重要作用，應(yīng)成為進(jìn)一步研究重點(diǎn)。

OA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇，中醫(yī)對(duì)其認(rèn)識(shí)較早，長時(shí)間臨床實(shí)踐顯示中藥具有良好有效性及安全性，且中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用機(jī)制，從中藥中尋找針對(duì)OA免疫機(jī)制整體調(diào)節(jié)的藥物應(yīng)作為研究重點(diǎn)［29-31］。OA中醫(yī)病機(jī)屬于年老體衰，肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)，外感風(fēng)寒濕邪氣，痹阻脈絡(luò)，流注關(guān)節(jié)［32］，證屬“本虛標(biāo)實(shí)”，以肝腎虧虛為主，風(fēng)寒濕邪為標(biāo)實(shí)。本次預(yù)測藥物的歸經(jīng)和功效分析，大部分藥物歸經(jīng)多屬于肺、肝腎經(jīng)且藥物多為補(bǔ)虛類、祛風(fēng)濕類、活血化瘀類、解表類等，進(jìn)一步說明本研究藥物預(yù)測結(jié)果符合OA中醫(yī)病機(jī)，且本研究預(yù)測藥物以藤類藥物居多，中醫(yī)學(xué)受“取類比象”思維影響，認(rèn)為藤類藥物形條達(dá)，纏繞蔓延，如同人體經(jīng)絡(luò)縱橫交錯(cuò)走行，具有通暢經(jīng)絡(luò)、舒通筋脈作用，善治痹證久治不愈，甚則變形之頑痹，完全符合OA病癥特點(diǎn)。本研究從免疫浸潤角度將OA差異基因中免疫相關(guān)BP及作用于PPI核心靶基因的中藥進(jìn)行反向預(yù)測，篩選出青風(fēng)藤、姜黃、雷公藤、藤黃等中藥在免疫調(diào)節(jié)干預(yù)OA過程中處于核心地位，現(xiàn)代藥理學(xué)也證實(shí)以上藥物可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)揮OA治療作用，如青風(fēng)藤可抑制TNF-α、IL-β、IL-6等炎癥因子產(chǎn)生，減少炎癥反應(yīng)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷［33］。此外，青風(fēng)藤還可抑制滑膜組織血管新生和血管炎癥，減少免疫細(xì)胞浸潤對(duì)滑膜的刺激；姜黃中有效成分姜黃素具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎作用，可抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB介導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞凋亡，保護(hù)軟骨［34］；雷公藤除抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血管新生外，還對(duì)滑膜有免疫調(diào)節(jié)功能，抑制T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡、恢復(fù)Th1/Th2細(xì)胞平衡［35-36］。以上文獻(xiàn)支持本研究結(jié)果的可信度，也為中藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎免疫機(jī)制候選中藥提供參考。

目前美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）、歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（EULAR）和中國2018版《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》均推薦針對(duì)OA治療的藥物，包括非甾體類抗炎藥（NSAIDs）、阿片類藥、糖皮質(zhì)激素、抗焦慮藥、軟骨保護(hù)藥等，促使消化道出血、腦、腎和心血管疾病、關(guān)節(jié)感染、藥物依賴性等風(fēng)險(xiǎn)性增加，長期使用飽受爭議，治療目的主要是減輕或消除疼痛，糾正畸形，改善或恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，但卻未對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，遠(yuǎn)期效果仍不理想［37-40］。對(duì)于晚期OA患者關(guān)節(jié)軟骨缺損，組織工程學(xué)方法的自體軟骨移植修復(fù)是目前研究熱點(diǎn)［41］。但關(guān)節(jié)周圍組織免疫微環(huán)境引發(fā)的自身免疫排斥反應(yīng)也是組織工程材料關(guān)節(jié)植入需考慮的關(guān)鍵問題。中醫(yī)藥是中國人民幾千年來的智慧結(jié)晶，其獨(dú)特魅力受到廣泛關(guān)注［42-43］。因此，從中草藥中尋找干預(yù)OA免疫失衡的潛在中藥，對(duì)早期OA患者減緩病程具有重要意義，對(duì)于晚期OA患者關(guān)節(jié)組織工程材料的特性選擇也具有指導(dǎo)意義。

本研究依賴于GEO數(shù)據(jù)庫，是既往發(fā)布數(shù)據(jù)集的二次挖掘和分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)論不同，原因可能為樣本量過少導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析偏倚。此外，CIBERSORT反卷積算法分析是基于有限的遺傳數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可能會(huì)偏離細(xì)胞異型相互作用、疾病的誘發(fā)因素以及疾病表型的可塑性，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。雖然本研究結(jié)果得到了多數(shù)文獻(xiàn)研究支持，但研究結(jié)果的可靠性仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。