江 雯，葉 晨，胡 熳，劉鈺偲，張 艷，梁繼超，陳 勇

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討澤瀉三萜抗肝纖維化的作用機制

江 雯，葉 晨，胡 熳，劉鈺偲，張 艷，梁繼超*，陳 勇*

湖北大學(xué) 藥物高通量篩選技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 中藥生物技術(shù)湖北省重點實驗室，省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北 武漢 430062

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探究澤瀉三萜成分抗肝纖維化的潛在作用機制。根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩選及文獻調(diào)研選取以澤瀉三萜中8種活性成分為研究對象，利用Swiss Target Prediction網(wǎng)絡(luò)平臺預(yù)測其作用靶點；通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取與肝纖維化有關(guān)的靶點，借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“活性成分-抗肝纖維化靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過度值篩選核心成分；使用String平臺進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，結(jié)合Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，通過度值、節(jié)點緊密度、節(jié)點介度篩選關(guān)鍵靶點；采用DAVID數(shù)據(jù)庫對澤瀉三萜抗肝纖維化的作用靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；使用AutoDock軟件對核心成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接；考察乙酰澤瀉醇C對油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠正常肝細胞（NCTC-1469）上清液一氧化氮（nitric oxide，NO）水平的影響。篩選出澤瀉三萜中8種活性成分包括24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C、澤瀉內(nèi)酯D、25-甲氧基澤瀉醇F，預(yù)測得到35個抗肝纖維化靶點，4個核心成分包括乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C，4個關(guān)鍵靶點包括蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PRKCA）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、磷酯酰肌醇-3激酶催化亞基γ（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ，PIK3CG）、MAPK8；基因富集分析得到GO功能條目142個、通路69條（＜0.05）；分子對接結(jié)果顯示，核心成分與關(guān)鍵靶點均有較強的潛在結(jié)合能力；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，澤瀉三萜成分主要通過作用于脂多糖反應(yīng)、凋亡等生物過程及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、MAPK等信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。體外細胞實驗結(jié)果顯示乙酰澤瀉醇C顯著降低肝損傷細胞模型NO水平（＜0.05）。澤瀉三萜中的活性成分乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C可能通過調(diào)節(jié)MAPK、PI3K/Akt等信號通路，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

澤瀉三萜；肝纖維化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；乙酰澤瀉醇B；16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B；澤瀉醇C；乙酰澤瀉醇C

肝纖維化的本質(zhì)是慢性肝病過程中的一種可逆的肝組織損傷過度修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化的主要發(fā)病機制包括肝脂代謝及能量代謝紊亂、慢性肝炎病毒感染等各種慢性損傷因素[1]，誘導(dǎo)靜止型肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞樣細胞[2]，誘導(dǎo)生成大量細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）[3]，并逐漸沉積于肝實質(zhì)形成纖維瘢痕，同時細胞產(chǎn)生大量炎性因子引發(fā)纖維結(jié)締組織過度增生，最終可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌[4]。引起肝纖維化的常見疾病包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、酒精性肝炎、遺傳代謝性肝病及膽汁瘀積性肝病等。目前NASH的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速上升[5-6]，約1/3以上的患者可能進展為纖維化[7]。

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉(Sam.) Juzep.的干燥塊莖，具有利水滲濕、化濁調(diào)脂等功效[8]。作為澤瀉的活性成分，澤瀉三萜類化合物具有抗炎等多方面活性[9-10]。高慧等[11]發(fā)現(xiàn)活血清肝飲（含澤瀉）可改善患者肝纖維化。韓曉穎等[12]發(fā)現(xiàn)澤瀉湯能夠顯著降低纖維化指標。此外多種有改善肝纖維化作用的中藥組方含有澤瀉[13-15]。研究表明，澤瀉三萜單體化合物24-乙酰澤瀉醇A可降低NASH小鼠模型中炎癥細胞因子的表達[16]；23-乙酰澤瀉醇B通過激活法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）降低膽堿蛋氨酸缺乏誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟炎癥標志物細胞趨化蛋白-1（monocyte ehemoattractant protein-1，）及纖維化標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transformed growth factor-β1，）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，）mRNA表達[17]。但澤瀉抗肝纖維化的作用機制并不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[18]和分子對接的方法，以澤瀉三萜類成分為研究對象，預(yù)測分析澤瀉三萜主要活性成分及其抗肝纖維化的潛在靶點，并利用細胞實驗對預(yù)測的結(jié)果進行驗證，為揭示澤瀉的抗纖維化機制提供參考。

1 材料

1.1 細胞

小鼠正常肝細胞NCTC-1469購買自杭州海晟生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

乙酰澤瀉醇C（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號B21764）購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；四季青胎牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）、胰酶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；油酸鈉（批號A1529012）購自上海阿拉丁生物公司；棕櫚酸、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT購自美國Sigma公司；NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；總一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（批號S0023）購自上海碧云天生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號23225）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；液氮罐（成都金鳳液氮容器有限公司）；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；XDS-1B型倒置相差顯微鏡（北京佳源興業(yè)科技有限公司）；BP211D型電子天平（德國Startorius公司）；JA3003型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；臺式低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；iMARKTM酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1 澤瀉三萜類活性成分庫的構(gòu)建 澤瀉三萜類成分是澤瀉分離出的主要化學(xué)成分，也是主要的活性成分。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)與分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫[19]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫SymMap平臺[20]（http:// www.symmap.org/）及文獻檢索查詢澤瀉的三萜類化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug- likeness，DL）≥0.18作為篩選條件[21]；在SymMap數(shù)據(jù)庫中設(shè)定OB≥30%作為篩選條件獲取有效三萜類成分[21]，同時查閱相關(guān)文獻補充部分未收錄但已經(jīng)報道的活性三萜類成分以構(gòu)成澤瀉三萜類活性成分庫。使用有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對檢索到的各個成分結(jié)構(gòu)進行比對確認，對于未收錄的化學(xué)成分根據(jù)文獻通過ChemDraw進行繪制，均保存為sdf格式文件。

2.1.2 澤瀉三萜類活性成分靶點庫的構(gòu)建 利用Swiss Target Prediction靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫[22]（http:// www.swisstargetprediction.ch/）、藥效團匹配與潛在識別靶標平臺PharmMapper數(shù)據(jù)庫[23]（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測澤瀉三萜類活性成分的作用靶點蛋白。在Swiss Target Prediction平臺中導(dǎo)入化合物結(jié)構(gòu)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，篩選Probability＞0，得到相關(guān)的靶點名稱、Uniprot ID等結(jié)果；在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中基于藥效團模型預(yù)測化合物的靶標蛋白，選擇“Human Protein Targets Only”，設(shè)置最終產(chǎn)生300個蛋白構(gòu)象，獲得所選成分潛在靶點的預(yù)測結(jié)果。將所篩選的活性成分靶點導(dǎo)入至Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www. uniprot.org/uploadlists/），限定物種為“human”，將檢索得到的所有蛋白靶標校正為Uniprot ID，并得到靶標蛋白所對應(yīng)的基因名。

2.1.3 肝纖維化疾病靶點庫的構(gòu)建 以“l(fā)iver fibrosis”“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim. org/）、CTD（http://ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫檢索肝纖維化疾病相關(guān)靶點，整合3個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果并刪除重復(fù)的基因靶點，得到肝纖維化疾病相關(guān)的靶點以構(gòu)建肝纖維化疾病靶點庫。

2.1.4 澤瀉三萜的“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將澤瀉三萜類活性成分靶點庫與肝纖維化疾病靶點庫取交集，獲得澤瀉三萜類活性成分治療肝纖維化的潛在作用靶點。運用Cytoscape 3.7.2軟件將活性成分與潛在作用靶點篩選結(jié)果導(dǎo)入，進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，通過節(jié)點和邊表示關(guān)鍵化合物和靶點及其之間的關(guān)系。利用Network Analyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，通過參考拓撲學(xué)參數(shù)對比化合物在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，參數(shù)包括節(jié)點介數(shù)中心性、節(jié)點緊密度和度值等，分析主要活性成分及核心靶點。

2.1.5 澤瀉三萜類“活性成分-肝纖維化”潛在靶點的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用String平臺[24]（https://www. string-db.org/），將潛在作用靶點導(dǎo)入后設(shè)置物種為“Homo sapiens”，將最低相互作用分值設(shè)為“medium confidence＝0.4”，隱藏沒有相互作用聯(lián)系的節(jié)點，其他參數(shù)設(shè)置不變以獲得PPI關(guān)系，導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件，之后導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中進行可視化分析，設(shè)置參數(shù)使節(jié)點大小和顏色深淺反映度值的大小，邊的粗細反映結(jié)合率評分的高低，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.6 澤瀉三萜類“活性成分-肝纖維化”潛在作用靶點的京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路和基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析 使用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8生物信息學(xué)分析平臺（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），將潛在作用靶點的Symbol錄入后，Identifier選擇為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物種為“Homo sapiens”，列表類型為“Gene List”，進行GO功能和KEGG通路富集分析。對潛在靶點進行GO功能分析，以研究澤瀉三萜類活性成分抗肝纖維化的主要生物功能包括可能存在的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC），并根據(jù)值使用GraphPad v8.3繪制柱狀圖；進行KEGG通路分析，以研究澤瀉三萜類活性成分抗肝纖維化的主要信號通路，將結(jié)果通過生物信息分析平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制成氣泡圖進行可視化。

2.1.7 澤瀉三萜的“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 篩選澤瀉三萜類活性成分靶點富集得到抗肝纖維化的主要信號通路以及各通路對應(yīng)的相關(guān)靶點，導(dǎo)入至CytoScape 3.7.2軟件[25]中構(gòu)建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，參數(shù)包括度值、介度等，分析主要活性成分及核心靶點。

2.1.8 澤瀉三萜活性成分與潛在靶點分子對接 為更好地闡述澤瀉三萜活性成分抗肝纖維化的潛在靶點與對應(yīng)的活性成分之間的結(jié)合活性，將“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的核心成分與關(guān)鍵潛在靶點進行分子對接。從PDB數(shù)據(jù)庫[26]（http://www.wwpdb.org/）中下載關(guān)鍵潛在靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)并保存為pdb格式，運用PyMOL軟件進行蛋白受體分子的前處理，運用Chemdraw 3D軟件進行活性化合物配體的前處理。將前處理好的潛在靶點和活性化合物成分導(dǎo)入對接軟件AutoDock[27]中進行分子對接，將結(jié)果保存為pdbqt格式。借助Open Babel 2.2軟件將結(jié)果文件轉(zhuǎn)化為pdb格式，使用PyMOL軟件將對接得分較高且構(gòu)象較穩(wěn)定的化合物與靶點蛋白，進行分子對接可視化分析。依據(jù)結(jié)果參數(shù)文件中配體與受體的結(jié)合能來判斷結(jié)合活性和可能性，一般認為配體與受體的結(jié)合能越低，其結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能＜0 kJ/mol認為化合物和靶蛋白可以自發(fā)結(jié)合，≤?17.78 kJ/mol時認為具有一定的結(jié)合活性，≤?20.92 kJ/mol時認為具有較好的結(jié)合活性，≤?29.29 kJ/mol時認為結(jié)合活性比較強烈[28]。

2.2 細胞實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng) NCTC-1469細胞用含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

2.2.2 NO測定 將NCTC-1469細胞以1×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對照組、模型組和乙酰澤瀉醇C（8、16、32 μmol/L）組，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，其余各組用含0.5 mmol/L油酸和0.25 mmol/L棕櫚酸的高糖DMEM完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)處理24 h使細胞脂肪變性[29]；各給藥組再加入藥物處理24 h，收集細胞。加入裂解液裂解細胞，取上清，一部分用于檢測NO含量，另一部分檢測蛋白濃度。使用總NO檢測試劑盒測定細胞內(nèi)NO含量，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。以對照組NO含量與蛋白濃度的比值為100%，計算各孔細胞內(nèi)NO的相對含量。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉三萜活性化學(xué)成分的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到澤瀉中的活性成分共46個，SymMap數(shù)據(jù)庫中檢索得到75個活性成分，根據(jù)ADME和Lipinski類藥五規(guī)則[30]標準篩選并結(jié)合相關(guān)文獻[17,31-32]補充，分析選取8個澤瀉三萜類活性成分為研究對象，分別為24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C、澤瀉內(nèi)酯D、25-甲氧基澤瀉醇F，其化合物結(jié)構(gòu)見圖1。

3.2 澤瀉三萜活性化學(xué)成分靶點的預(yù)測

將各個澤瀉三萜類活性成分分別導(dǎo)入Swiss Target Prediction和PharmMapper預(yù)測活性成分的潛在靶點，Swiss Target Prediction預(yù)測結(jié)果選擇各個化合物可能性最高的前15位預(yù)測靶點，PharmMapper數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果篩選“Norm Fit＞0.9”的靶點，合并后刪除重復(fù)值共獲得111個基因靶點。

3.3 肝纖維化相關(guān)靶點獲取結(jié)果

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫檢索出7238個靶點，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出6161個靶點，CTD數(shù)據(jù)庫中檢索出93 367個靶點，根據(jù)相關(guān)性打分篩選，合并3個數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果并去除重復(fù)項共選取1330個靶點，采用這些靶點組建了肝纖維化相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫。

3.4 澤瀉三萜“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析

利用VENNY2.1在線平臺（https://bioinfogp cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對澤瀉三萜類活性成分靶點與肝纖維化相關(guān)靶點取交集，得到澤瀉三萜類活性成分治療肝纖維化可能的35個作用靶點基因，包括絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PRKCA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG）、磷酯酰肌醇-3激酶催化亞基γ（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ，PIK3CG）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等，交集靶點信息見表1。將篩選出的8個澤瀉三萜活性成分和35個潛在作用靶點利用Cytoscape 3.7.2軟件進行“活性成分-肝纖維化”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示，該網(wǎng)絡(luò)包含43個節(jié)點，165條相互作用的邊，外圈節(jié)點表示35個潛在作用靶點，內(nèi)圈節(jié)點表示8個活性成分。進行網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)分析，得到節(jié)點介度、節(jié)點緊密度、度值等數(shù)據(jù)，其中度值代表與節(jié)點相關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)量，度值越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。由表2可以看出，乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C具有較好的拓撲學(xué)參數(shù)，在“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中較其他化合物更重要。

圖1 澤瀉三萜成分化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig. 1 Chemical structures of triterpenes from A. orientalis

表1 澤瀉三萜活性成分靶點與肝纖維化靶點交集信息

Table 1 Intersection information between triterpene active components of A. orientalis and hepatic fibrosis targets

Uniprot ID靶點Uniprot ID靶點 P35228NOS2P42574CASP3 Q13133NR1H3P04035HMGCR P06276BCHEP35968KDR P37231PPARGP08254MMP3 Q05655PRKCDP02766TTR P09211GSTP1P25024CXCR1 Q14994NR1I3P28482MAPK1 P04150NR3C1P48736PIK3CG Q16539MAPK14Q00987MDM2 P02774GCP00533EGFR P55055NR1H2Q9HBA0TRPV4 P00734F2P45983MAPK8 P35354PTGS2P80188LCN2 P12643BMP2P02768ALB P03372ESR1O75469NR1I2 P04062GBAP10275AR P62937PPIAP17252PRKCA P49841GSK3B

3.5 澤瀉三萜“活性成分-肝纖維化”潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

借助String平臺輸入35個潛在作用靶點，獲得包含35節(jié)點的PPI網(wǎng)絡(luò)，隱藏沒有相互作用聯(lián)系的節(jié)點，通過Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化，如圖3所示，共34個節(jié)點，度值越大，節(jié)點越大；連接評分越高，邊越粗。拓撲學(xué)參數(shù)表明，PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點介度的中位數(shù)為0.005 862 64、節(jié)點緊密度的中位數(shù)為0.550 152 82、度值的中位數(shù)為8，經(jīng)3個參數(shù)綜合篩選關(guān)聯(lián)度最高的3個靶點分別為白蛋白（albumin，ALB）、MAPK1和EGFR，提示它們可能是澤瀉三萜活性成分抗肝纖維化的關(guān)鍵靶點。

圖2 澤瀉三萜“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 澤瀉三萜在“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中的拓撲學(xué)分析

Table 2 Topological analysis of A. orientalis triterpenes in network of “active ingredients-potential targets against liver fibrosis”

成分介數(shù)中心性緊密度度值 乙酰澤瀉醇B0.164 576 560.560 000 0022 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B0.152 336 230.545 454 5521 澤瀉醇C0.173 364 280.545 454 5521 乙酰澤瀉醇C0.148 704 160.531 645 5720 澤瀉醇B0.153 719 170.506 024 1018 24-乙酰澤瀉醇A0.096 293 670.471 910 1115 25-甲氧基澤瀉醇F0.052 383 620.451 612 9013 澤瀉內(nèi)酯D0.070 236 710.415 841 589

3.6 澤瀉三萜“活性成分-肝纖維化”潛在靶點GO功能與KEGG通路富集分析

通過DAVID 6.8在線平臺對35個潛在作用靶點進行GO功能富集分析，設(shè)定＜0.05，總共富集到142條生物學(xué)過程或通路，其中96個與BP相關(guān)、15個與MF相關(guān)、31個與CC相關(guān)。根據(jù)值從小到大排列，各選取排名前10位結(jié)果繪制柱狀圖，由圖4可以看出，澤瀉三萜活性成分可能參與眾多過程，BP主要涉及甾體激素介導(dǎo)的信號通路、脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號通路、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）介導(dǎo)的信號通路、MAPK活性、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）活性等；MF主要涉及到類固醇激素受體活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、MAPK活性等；CC主要涉及蛋白質(zhì)復(fù)合體、細胞核、胞質(zhì)、核質(zhì)等。

圖3 澤瀉三萜“活性成分-肝纖維化”潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖

對35個潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析，設(shè)定＜0.05，共獲得69條富集通路，按照值從小到大排列且篩選富集靶點數(shù)＞5的通路，結(jié)合文獻篩選出與肝纖維化相關(guān)的14條主要通路，14條通路的富集氣泡圖見圖5，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路、酪氨酸激酶受體2（tyrosine kinase receptor 2，ErbB）信號通路、炎癥介質(zhì)對瞬時感受器電位（transient receptor potential，TRP）通道的調(diào)節(jié)、胰島素抵抗、甲狀腺激素信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、雌激素信號通路等。

圖4 GO功能富集分析(前10)

圖5 KEGG通路富集分析

3.7 澤瀉三萜“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果選取的14條相關(guān)性高的信號通路，同時與這些相關(guān)通路的靶點建立相互作用聯(lián)系，將活性成分、通路靶點、信號通路通過CytoScape 3.7.2軟件進行可視化，如圖6所示，包括58個節(jié)點和238條邊，根據(jù)拓撲學(xué)數(shù)據(jù)表明，乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C可能是澤瀉三萜治療肝纖維化的主要活性成分；PRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8可能是澤瀉三萜治療肝纖維化的主要作用靶點。

圖6 澤瀉三萜“活性成分-潛在靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

3.8 澤瀉三萜主要活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

根據(jù)GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果，初步選擇“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的4個作用靶點PRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8，分別以4個度值較大的核心成分乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C為對象進行分子對接。選取該靶點所對應(yīng)的配體作為參考來對比對接結(jié)果，所選取的靶點信息和對接打分情況如表3所示。所有核心成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能均≤?20.92 kJ/mol，其中乙酰澤瀉醇B與MAPK1、PIK3CG、MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol且強于PIK3CG特異性配體；16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B與MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol；澤瀉醇C與MAPK1、MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol且強于MAPK1特異性配體；乙酰澤瀉醇C與MAPK1、MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol且強于MAPK1特異性配體，以上結(jié)果表明活性成分與關(guān)鍵靶點具有較強的結(jié)合活性，它們之間的相互作用見圖7。

表3 分子對接驗證結(jié)果

Table 3 Verification results of molecular docking

靶點PDB ID活性成分結(jié)合能/(kJ·mol?1)抑制劑常數(shù)/(μmol·L?1) PRKCA3IW4乙酰澤瀉醇B?25.1539.55 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?22.72105.37 澤瀉醇C?23.0193.11 乙酰澤瀉醇C?26.2824.81 LW4（unique ligands）?43.430.024 67 MAPK16SLG乙酰澤瀉醇B?31.133.53 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?25.8629.54 澤瀉醇C?30.794.05 乙酰澤瀉醇C?38.160.206 59 LHZ（unique ligands）?29.336.91 PIK3CG2A4Z乙酰澤瀉醇B?30.254.99 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?24.3554.3 澤瀉醇C?23.8566.54 乙酰澤瀉醇C?22.30123.28 BYM（unique ligands）?27.0717.97 MAPK84QTD乙酰澤瀉醇B?32.551.99 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?31.712.78 澤瀉醇C?33.051.62 乙酰澤瀉醇C?30.175.18 38Z（unique ligands）?43.810.021 25

圖7 澤瀉三萜主要活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

3.9 乙酰澤瀉醇C對NCTC-1469細胞上清液NO水平的影響

為了研究乙酰澤瀉醇C對炎癥相關(guān)指標的影響，檢測乙酰澤瀉醇C對油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的NCTC-1469細胞上清液NO水平，結(jié)果如圖8所示，NCTC-1469細胞經(jīng)油酸和棕櫚酸處理后，細胞上清液NO水平顯著高于對照組（＜0.01）；經(jīng)乙酰澤瀉醇C（32 μmol/L）處理24 h后，細胞上清液NO水平顯著降低（＜0.05）。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05

4 討論

澤瀉具有調(diào)血脂和降血糖等多種藥理作用，常被用于治療脂肪肝、高脂血癥等。近年來，有大量研究發(fā)現(xiàn)澤瀉三萜成分具有良好的肝保護作用，尤其是對非酒精性脂肪性肝臟損傷具有較好的保護作用，而肝纖維化則是這類慢性肝損傷所導(dǎo)致的肝臟細胞外基質(zhì)過度沉積產(chǎn)生的綜合效應(yīng)，其作用機制仍未明確。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)[33]篩選了澤瀉三萜成分抗肝纖維化的主要活性成分及潛在作用靶點，探討其抗肝纖維化可能的作用機制。

本研究共篩選出8個澤瀉三萜類活性化學(xué)成分，包括24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C、澤瀉內(nèi)酯D、25-甲氧基澤瀉醇F。據(jù)文獻報道，澤瀉三萜單體化合物24-乙酰澤瀉醇A可降低NASH小鼠模型中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，抑制炎癥細胞因子的表達[17]。23-乙酰澤瀉醇B可通過激活FXR信號通路，降低蛋氨酸及膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟炎癥標志物及纖維化標志物的mRNA水平，從而降低肝臟脂質(zhì)積聚、肝小葉炎癥和細胞外纖維化水平[18]，Huo等[34]研究表明23-乙酰澤瀉醇B能激活FXR保護對α-萘異硫氰酸鹽或雌激素所致肝損傷，對III型炎癥反應(yīng)有一定的抑制活性，還能改善炎細胞浸潤及肝纖維化。李小艷等[35]發(fā)現(xiàn)澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇C表現(xiàn)出一定的促進小鼠胚胎成纖維3T3-L1細胞葡萄糖攝取作用，有一定的降血糖功效。此外，Jin等[32]從澤瀉中分離得到的6個四環(huán)三萜類新化合物alisolides A～F均能不同程度地抑制脂多糖誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco2細胞NO生成，緩解炎癥反應(yīng)。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對澤瀉三萜主要成分進行了相關(guān)活性預(yù)測，以期篩選到具有一定抗NASH肝纖維化活性的澤瀉單體化合物。其中乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C在網(wǎng)絡(luò)中度值較大，可能為主要的活性成分。根據(jù)GO功能和KEGG通路富集分析，進一步表明澤瀉三萜成分抗肝纖維化作用可能與TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路、ErbB信號通路、炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)、胰島素抵抗、FoxO信號通路等有關(guān)。其中顯著性最高的TNF信號通路，被報道可誘導(dǎo)激活下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），抑制基因的表達，刺激HSC增殖和膠原合成，加重肝纖維化的病理進程[36]；也有研究認為TNF是炎癥反應(yīng)和肝纖維化的調(diào)節(jié)分子，可激活NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）阻止肝臟損傷和纖維化進展[37]。此外成功構(gòu)建了“活性成分-潛在靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，潛在作用靶點中RRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8顯示出較高的關(guān)聯(lián)度，是該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點。提示澤瀉三萜活性成分治療肝纖維化與RRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8靶點密切相關(guān)。

分子對接結(jié)果顯示，澤瀉三萜成分中度值較高的4種核心成分乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C與關(guān)鍵作用靶點蛋白RRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8結(jié)合能均≤?17.78 kJ/mol，并且這4種核心成分與MAPK8的結(jié)合能均≤?20.92 kJ/mol，表明澤瀉活性成分與潛在靶點分子生物親和力高，具有較高的藥效活性，其中乙酰澤瀉醇C與MAPK1靶點結(jié)合能力最好。PRKCA是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其相關(guān)通路包括MAPK通路，Pan等[38]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PRKCA可作為促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）、MAPK/ERK等信號通路的負調(diào)控因子，調(diào)節(jié)miR-16從而抑制HSC活化，降低肝纖維化的程度。MAPK1稱為ERK2，在細胞的增殖分化中起著重要的調(diào)控作用[39]。Jeng等[40]發(fā)現(xiàn)ERK2信號通路通過FOXM1、MMP9、CD133等多種肝細胞癌相關(guān)生物標志物調(diào)控肝纖維化進程，同時在肝纖維化小鼠模型中，ERK2?/?通過調(diào)節(jié)ERK信號通路使肝纖維化細胞增殖減少、α-SMA蛋白水平降低、肝纖維化程度降低、炎癥反應(yīng)減少。PIK3CG又被稱為PI3K，是肌醇磷脂的磷酸化產(chǎn)物，其相關(guān)通路有MAPK通路和2型糖尿病，Lei等[41]發(fā)現(xiàn)miR-101可通過靶向雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路來減少ECM積累，逆轉(zhuǎn)肝纖維化。MAPK8被稱為c-Jun氨基末端激酶1（c-Jun-terminal kinase 1，JNK1），參與炎癥等病理過程中的調(diào)控[42]。有文獻報道TGF-β和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）均可通過JNKs激活Smad2和Smad3，導(dǎo)致HSC遷移，其中JNK1?/?小鼠中α-SMA蛋白水平降低，對肝纖維化有保護作用[43]。上述文獻研究結(jié)果表明，PRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8均與MAPK信號通路存在一定相關(guān)性。MAPK信號傳導(dǎo)通路是經(jīng)典的有絲分裂通路，是信號從細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細胞核內(nèi)的重要傳遞者。近期的研究表明，MAPK信號通路與人體多種臟器纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[44]。MAPK信號通路可以通過對HSC活化、增殖、凋亡的調(diào)控參與肝纖維化的形成[45]。NO水平隨肝纖維化程度加深而逐漸升高，可能成為反映肝纖維化及其活動性的指標之一[46-47]。體外實驗結(jié)果顯示，乙酰澤瀉醇C處理后能降低脂變性細胞的NO含量。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及體外細胞實驗結(jié)果，推測乙酰澤瀉醇C可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，減少肝細胞NO的生成，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，本研究系統(tǒng)揭示了澤瀉三萜成分能通過多靶點-多途徑共同調(diào)控肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，為澤瀉的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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JIANG Wen, YE Chen, HU Man, LIU Yu-cai, ZHANG Yan, LIANG Ji-chao, CHEN Yong

National & Local Joint Engineering Resarch Center of High-throughput Drug Screening Technology, Hubei Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine, State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China

To explore the potential mechanism of triterpenoids fromagainst liver fibrosis based on network pharmacology and molecular docking method.According to database screening and literature investigation, eight active components fromtriterpenes were selected as research objects, and their action targets were predicted by Swiss Target Prediction network platform, targets related to liver fibrosis were obtained through GeneCards and OMIM databases, and “active ingredients-anti-liver fibrosis targets” network was constructed by Cytoscape 3.7.2 software; Protein-protein interaction (PPI) analysis was carried out by String platform, PPI network diagram was constructed by Cytoscape 3.7.2 software, key targets were screened by degree value, node tightness and node degree. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on anti-liver fibrosis targets oftriterpenes were carried out by DAVID database; AutoDock software was used for molecular docking between core components and key targets; Effect of acetyl alisol C on nitric oxide (NO) levels in supernatant of NCTC-1469 cells induced by oleic acid and palmitic acid was investigated.Eight active components oftriterpenes including alisol A 24-acetate, alisol B, alisol B monoacetate, 16β-methoxyalisol B monoacetate, alisol C, alisol C monoacetate, alisolides D and 25--methyalisol F were obtained. Thirty-five anti-liver fibrosis targets were predicted, four core components including alisol B monoacetate, 16β-methoxy alisol B monoacetate, alisol C and alisol C monoacetate and four key targets including protein kinase Cα (PRKCA), mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ (PIK3CG) and MAPK8 were selected. GO enrichment analysis revealed 142 GO functional entries and 69 pathways (< 0.05). Results of molecular docking showed that core components displayed strong binding abilities with key targets respectively. Network pharmacological analysis showed thattriterpenoids played an anti-hepatic fibrosis role through lipopolysaccharide reaction, apoptosis and other biological processes, as well as tumor necrosis factor (TNF), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt), MAPK and other signal pathways. Results of cell experimentsshowed that NO content in liver injury cell model was decreased after treatment with alisol C monoacetate (< 0.05).Active components oftriterpenes such as alisol B monoacetate, 16β-methoxy alisol B monoacetate, alisol C and alisol C monoacetate may play an anti-liver fibrosis effect by regulating MAPK, PI3K/Akt and other signaling pathways.

triterpenes; liver fibrosis; network pharmacology; alisol B monoacetate; 16β-methoxy alisol B monoacetate; alisol C; alisol C monoacetate

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1100 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.017

2021-10-20

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（X202010512076，X202010512072）

江 雯，女，博士研究生，研究方向為微生物與生化藥學(xué)。Tel: 15972013245 E-mail: jiangwenhubu@gmail.com

梁繼超，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事分子藥理學(xué)研究。Tel: (027)88663882 E-mail: liang529114@163.com

陳 勇，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事分子藥理學(xué)和藥動學(xué)研究。Tel: (027)88663590 E-mail: cy101610@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]