陳瀅鍇　張紅云,2　彭小玉　陳海蘭　王金子　齊豫川

兩種豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒效果評(píng)價(jià)

陳瀅鍇1張紅云1,2彭小玉1陳海蘭1王金子2,3齊豫川4

（1.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530005；2.廣西璞締恩葳生物技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530007；3.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530006；4.中國科技開發(fā)院廣西分院，廣西 南寧 530022）

目的：為了評(píng)估A、B兩種豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果，為豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒提供選擇依據(jù)。方法：試驗(yàn)將12份待檢血清樣品進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算A、B試劑盒的符合率和陽性率；通過對(duì)3份留樣血清樣品進(jìn)行梯度稀釋、設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估兩種試劑盒的重復(fù)性、靈敏度和穩(wěn)定性。結(jié)果：用兩種試劑盒檢測(cè)，樣品的陽性率均為33.3%，符合率為100%；通過稀釋留樣血清樣品的檢測(cè)和平行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用A試劑盒檢測(cè)兩份樣品，檢出顯示陽性的最低稀釋度分別為1∶64和1∶16；用B試劑盒檢測(cè)2份樣品，檢出顯陽性的最低稀釋度分別為1∶32和1∶8。結(jié)論：兩種試劑盒重復(fù)性好，均適用于臨床樣品的PRV gE抗體檢測(cè)，但A試劑盒靈敏度高于B試劑盒，而B試劑盒穩(wěn)定性更高且價(jià)格更低。說明生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)對(duì)A、B試劑盒的重復(fù)性、靈敏度、穩(wěn)定性和價(jià)格因素進(jìn)行綜合考量，合理選擇性價(jià)比更高試劑盒。

豬偽狂犬?。籫E抗體；ELISA檢測(cè)；靈敏度比較

引言

偽狂犬病（pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染豬、牛、羊等多種家畜和野生動(dòng)物引起的一種高度接觸性傳染病。豬是該病毒的主要天然宿主、貯存者和傳播者[1,2]。豬被感染的典型臨床特征是妊娠階段的母豬出現(xiàn)流產(chǎn)，哺乳仔豬出現(xiàn)高熱、神經(jīng)癥狀，仔豬流產(chǎn)率高、死亡率高[3]，育成階段的豬表現(xiàn)為體表皮膚瘙癢，出現(xiàn)疹塊危及到豬群的健康成長。偽狂犬病在全球養(yǎng)豬業(yè)普遍存在[4]，我國自1947年首次報(bào)道該病以來，已有20多個(gè)省（自治區(qū)、市）流行過該病，并在許多豬場(chǎng)呈暴發(fā)性流行[5]，偽狂犬病是現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)要面對(duì)的主要病原之一，對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重[6]。近年來，更有報(bào)道認(rèn)為PRV可引起人眼內(nèi)炎和腦炎[7-9]。這些發(fā)現(xiàn)表明PRV感染是一個(gè)潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，不僅限于養(yǎng)豬業(yè)。因此，研究豬偽狂犬gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的效果對(duì)豬偽狂犬病的檢測(cè)與凈化刻不容緩。陳偉杰、董雅琴等研究者曾對(duì)市場(chǎng)上的一些PR gE抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了比較分析，給出了一定的建議。其中，陳偉杰等[10]側(cè)重于對(duì)不同試劑盒之間檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)，董雅琴等[11]側(cè)重于比較分析各試劑盒敏感性、特異性以及試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。楊濤[1]、陸江[12]等均對(duì)進(jìn)口試劑盒進(jìn)行比較研究。段群棚[13]、宋詩川[5]等均采用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。目前沒有研究對(duì)市場(chǎng)上廣泛使用的外國和國產(chǎn)品牌的檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性、符合率及價(jià)格等方面進(jìn)行系統(tǒng)地比較分析，忽略了國產(chǎn)試劑盒的重要性。本研究從試劑盒的檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性、符合率及價(jià)格等方面進(jìn)行比較分析，為養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中選擇更合理PRV gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒提供依據(jù)。

1　材料

1.1　血清樣品

南寧市某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的12份臨床背景清楚的待檢血清樣品和實(shí)驗(yàn)室留樣保存的3份血清樣品。

1.2　試劑

A廠家生產(chǎn)的PRV gE 抗體試劑盒（批號(hào)為AT 069，阻斷ELISA），簡(jiǎn)稱A試劑盒；B廠家生產(chǎn)的PRV gE 抗體試劑盒（批號(hào)為EP 0621017，阻斷ELISA），簡(jiǎn)稱B試劑盒。

1.3　主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為DHP-9162），購自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)為F50），購自帝肯（上海）貿(mào)易有限公司。

2　方法

2.1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1待檢血清樣品的檢測(cè)

將12份待檢血清按順序編號(hào)，按照試劑盒說明書要求分別用A、B兩種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其符合率（指A、B試劑盒檢測(cè)同一樣品同時(shí)定性為陽性或陰性數(shù)量之和除以檢測(cè)總數(shù)）和陽性率。

2.1.2留樣血清樣品的檢測(cè)

3份留樣血清樣品經(jīng)梯度稀釋后用A、B試劑盒檢測(cè)，共設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)3次，對(duì)兩種試劑盒的重復(fù)性和靈敏度進(jìn)行評(píng)估；對(duì)3份樣品不同稀釋度的3個(gè)結(jié)果（OD值）計(jì)算變異系數(shù)（CV=平均值/標(biāo)準(zhǔn)差），再計(jì)算每個(gè)樣品的平均變異系數(shù)，以衡量?jī)煞N試劑盒的穩(wěn)定性。

2.2　結(jié)果判定

計(jì)算公式：S/N值＝樣品OD值/陰性對(duì)照OD值

A試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N值≤0.6為陽性，S/N值＞0.7為陰性，S/N值在0.6～0.7判為可疑。

B試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N值≤0.6為陽性，S/N值＞0.6為陰性。

3　結(jié)果與分析

3.1　待檢血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

用A、B試劑盒對(duì)12份待檢血清樣品的gE抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品3、樣品6、樣品7、樣品8四份樣品均為陽性，其余樣品均為陰性，陽性率均為33.3%（見表1）；12份樣品中同時(shí)為陽性的樣品有4份，同時(shí)為陰性的樣品有8份，無可疑項(xiàng)，故兩種試劑盒的符合率為100%（見表2）。

表1　A、B試劑盒對(duì)待檢血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

表2　A、B試劑盒對(duì)待檢血清樣品的檢測(cè)結(jié)果的符合率

3.2 留樣血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

用A、B試劑盒檢測(cè)三份留樣血清樣品，結(jié)果均顯示樣品1、樣品3為陽性，樣品2為陰性（見表3至表4）。用A試劑盒檢測(cè)樣品1和樣品3，檢出顯示陽性的最低稀釋度分別為1∶64和1∶16；用B試劑盒檢測(cè)樣品1和樣品3，檢出顯陽性的最低稀釋度分別為1∶32和1∶8；（見圖1和圖3）故判斷A試劑盒檢測(cè)靈敏度更高，A、B試劑盒均能有效檢出樣品2為陰性（見圖2）。A、B試劑盒各稀釋度的平均變異系數(shù)都小于10%，說明其重復(fù)性良好，B試劑盒各稀釋度平均變異系數(shù)均小于A試劑盒，說明其重復(fù)性最好，穩(wěn)定性最高（見圖4）。

表3　A試劑盒對(duì)留樣血清樣品的檢測(cè)結(jié)果（n=3）

注：S/N值取X±S，其中X為三次平行試驗(yàn)S/N值的平均值；S為三次平行試驗(yàn)S/N值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表4　B試劑盒檢測(cè)結(jié)果（n=3）

注：S/N值取X±S，其中X為三次平行試驗(yàn)S/N值的平均值；S為三次平行試驗(yàn)S/N值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖1 樣品1檢測(cè)結(jié)果

注：S/N值低于0.6判定為陽性，下同。

圖2 樣品2檢測(cè)結(jié)果

圖3 樣品3檢測(cè)結(jié)果

圖4　留樣血清檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)比較

4　討論

目前，國內(nèi)基本上是通過PRV gE基因缺失疫苗配合gE-ELISA檢測(cè)試劑盒來剔除野毒感染豬，并加強(qiáng)豬場(chǎng)生物安全措施、引種監(jiān)測(cè)、嚴(yán)防新毒株的傳入，開展豬偽狂犬病的控制與凈化工作[14]。gE基因是PRV的非必需基因，PRV缺失gE基因后，病毒毒力降低，但不會(huì)影響病毒的復(fù)制擴(kuò)增和免疫原性[15]，因此gE基因是PRV一個(gè)良好的標(biāo)記基因，目前市面上廣泛使用的PRV疫苗，就是利用這個(gè)原理，缺失了gE基因降低了PRV的病毒毒力，但保留了原毒株的免疫原性[16,17]，因此在疫苗免疫后檢測(cè)不到gE抗體；而PRV所有野毒株有g(shù)E基因，在被PRV野毒感染的豬體內(nèi)能檢測(cè)到gE蛋白，這為利用分子生物學(xué)和血清學(xué)方法進(jìn)行PRV 野毒感染和gE基因缺失疫苗鑒別診斷提供了條件[18]。國內(nèi)大多豬場(chǎng)只使用gE基因缺失的偽狂犬疫苗，故利用gE抗體檢測(cè)來區(qū)分養(yǎng)殖場(chǎng)是否被PRV野毒感染。

當(dāng)前PR的傳播給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而對(duì)PR野毒的及時(shí)檢出，是豬場(chǎng)制定有效治療和防控措施的關(guān)鍵。由于PRV gE基因缺失疫苗被廣泛應(yīng)用，通過對(duì)豬血清中PRV gE抗體的檢測(cè)，可判斷豬場(chǎng)是否存在野毒感染。此方法也是目前豬場(chǎng)進(jìn)行PR診斷和凈化重要且有效的手段。目前檢測(cè)gE蛋白特異性抗體的方法主要有病毒中和試驗(yàn)（VNT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）。其中，VNT因不適宜于大面積的臨床診斷與篩查而難以在實(shí)際生產(chǎn)中[19,20]；LAT具有較高的可靠性，但其較復(fù)雜的操作方法也限制了它的廣泛應(yīng)用[21]。生豬養(yǎng)殖場(chǎng)普遍采用的是基于阻斷ELISA原理的gE蛋白特異性抗體檢測(cè)試劑盒，具有操作簡(jiǎn)單、通量高等優(yōu)勢(shì)，備受臨床從業(yè)人員的青睞[22]。但各廠家的試劑盒在質(zhì)量和價(jià)格上存在較大差異，因此，如何選擇準(zhǔn)確的診斷試劑盒是目前普遍存在的問題。

本試驗(yàn)通過對(duì)12份待檢血清樣品和3份留樣血清樣品的全面檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種試劑盒對(duì)待檢血清樣品的檢出率均為33.3%，符合率為100%，均適用于臨床樣品的PRV gE抗體檢測(cè)。但是通過稀釋留樣血清樣品的檢測(cè)和平行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A試劑盒的靈敏度高于B試劑盒，但B試劑盒穩(wěn)定性更高且價(jià)格更低。此外，本試驗(yàn)A試劑盒符合率與楊濤等[1]結(jié)果相似，與其他廠家生產(chǎn)的試劑盒相比有較高的符合率，gE抗體陽性率33.3%與段群棚等[13]的檢測(cè)結(jié)果相符；比宋詩川檢測(cè)結(jié)果偏高，可能是本試驗(yàn)樣品數(shù)量較少或與豬場(chǎng)間PRV防控水平差異相關(guān)，也可能是與gE抗體陽性率呈上升趨勢(shì)有關(guān)[5]。陸江等[12]直接將A試劑盒的檢測(cè)數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)其他廠家的試劑盒，表現(xiàn)出A試劑盒具有良好的檢測(cè)效果。B試劑盒檢測(cè)結(jié)果與董雅琴等的數(shù)據(jù)有所差別，可能是不同批次間重復(fù)性較差[11]。

5 結(jié)論

綜上所述，A、B試劑盒檢測(cè)結(jié)果高度一致，均可應(yīng)用于臨床檢測(cè)。而A試劑盒是經(jīng)過我國農(nóng)業(yè)部注冊(cè)的PRV進(jìn)口診斷產(chǎn)品，靈敏度更高，同時(shí)其操作方法也列入了農(nóng)業(yè)部的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量經(jīng)過了嚴(yán)格的檢驗(yàn)，在國內(nèi)和國際上都被高度認(rèn)可；B試劑盒為常用國產(chǎn)診斷產(chǎn)品，在試劑盒成本上更具優(yōu)勢(shì)，且穩(wěn)定性更佳，若要對(duì)PRV野毒抗體進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，就需試劑盒具備較好的穩(wěn)定性，以保證監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性，這時(shí)應(yīng)選擇B試劑盒。若用于PR凈化則建議使用靈敏度較高的A試劑盒，但A試劑盒成本更高，臨床檢測(cè)需綜合考量。

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Effect Evaluation of Two ELISA Kits for Detecting gE Antibody in Swine Pseudorabies

Objective: To evaluate the detection effect of ELISA kit for gE antibody of swine pseudorabies A and B, and to provide a basis for selection of ELISA kit for gE antibody of swine pseudorabies. Methods: 12 serum samples were tested and the coincidence rate and positive rate of kit A and B were calculated; the repeatability, sensitivity and stability of the two kits were evaluated by gradient dilution of 3 retention serum samples and parallel test. Results: The positive rate of samples was 33.3% and the coincidence rate was 100% when tested with two kinds of kits; through the detection of diluted serum samples and parallel test, it was found that the lowest dilution of positive results were 1∶64 and 1∶16 respectively when two samples were detected with kit A; two samples were tested with kit B, and the minimum dilution of positive reaction was 1∶32 and 1∶8, respectively. Conclusion: The two kits have good repeatability and are suitable for the detection of PRV gE antibody in clinical samples. However, the sensitivity of kit A is higher than that of kit B, while kit B has higher stability and lower price. It indicates that the repeatability, sensitivity, stability and price factors of A and B reagent kits should be comprehensively considered in production practice, and a more cost-effective kit should be reasonably selected.

swine pseudorabies; gE antibody; ELISA test; sensitivity comparison

S828

A

1008-1151(2022)12-0039-04

2022-09-23

南寧市優(yōu)秀青年科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才培育項(xiàng)目（RC20190102）。

陳瀅鍇（1998－），男，四川宜賓人，廣西大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疾病快速檢測(cè)。

王金子（1982－），男，黑龍江齊齊哈爾人，廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源利用；齊豫川（1991－），男，河南鄭州人，中國科技開發(fā)院廣西分院工程師，碩士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。