鄭學良，李偉林，梁 青，馬 耀

(山西省化工研究所(有限公司)，山西 太原 030021)

多靶點藥物已成為最有前景的抗腫瘤藥物之一[1]。由PI3K介導的PI3K/AKT信號通路是調控細胞生長、增殖、分化及凋亡的關鍵信號通路之一，在細胞的生命進程中發(fā)揮著至關重要的作用[2]。PI3K/AKT信號通路的失調會引發(fā)多種腫瘤的發(fā)生，因此，PI3K激酶成為腫瘤治療的重要靶點之一，目前通路中關鍵節(jié)點的不同類型的抑制劑正處于臨床研究階段，用以治療人體惡性腫瘤[3-6]。

由于氟原子的電負性強，原子半徑與氫原子半徑相近，具有形成分子間氫鍵的特點[7]。將氟原子或含氟基團引入到小分子藥物中，對藥物結構進行細微的修飾和調整，不但阻斷了易代謝的位點，造成藥物代謝的途徑和速度發(fā)生了改變，而且延長了藥物在體內的作用時間，提高了生物利用度和選擇性[8]。在藥物化學中，氟代是最常用、最有效的一種結構修飾方法[9]。

基于PI3Kδ抑制劑IC-87114的結構和氟原子的特點，作者設計并合成3個新型含氟嘌呤喹唑啉酮類PI3Kδ抑制劑，通過1HNMR、LC-MS等對其結構進行表征，并對其抗腫瘤活性進行評價，以期通過含氟位置的變化發(fā)現(xiàn)活性更高的化合物結構，為含氟PI3Kδ抑制劑的進一步研究提供思路。合成路線如圖1所示。

圖1 含氟嘌呤喹唑啉酮類PI3Kδ抑制劑的合成路線

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

小鼠結腸癌細胞CT-26，上海弘順生物科技有限公司；小鼠(品系：NOD/SCID)，華阜康實驗動物技術有限公司。

柱層析硅膠(200～300目)、硅膠薄層板，青島海洋化工廠；IC-87114原藥，上海Sellcek公司；其它試劑均為分析純。

Bruker AM-600型核磁共振儀；液質聯(lián)用儀，美國 Waters公司；倒置顯微鏡，日本 Olympus公司；離心機，美國Thermo公司；電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；R-1001VN型旋轉蒸發(fā)儀、DLSB-5/20B型低溫冷卻液循環(huán)泵、SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 化合物的合成

1.2.1 中間體2-氨基-6-甲基苯甲酰氯的合成

將2-氨基-6-甲基苯甲酸15 g(99.3 mmol)加入到150 mL甲苯中，加入氯化亞砜30 mL(411 mmol)，升溫回流1 h；旋干溶劑，無需純化，直接用于下一步反應。

1.2.2 中間體Ⅰ的合成

1.2.2.1 中間體Ⅰa的合成

將2-氨基-6-甲基苯甲酰氯2.5 g(14.7 mmol)加入到20 mL無水四氫呋喃中，冰浴降溫到0 ℃，氮氣保護；將鄰甲基苯胺1.5 mL(15 mmol)溶于5 mL無水四氫呋喃中，緩慢滴加到2-氨基-6-甲基苯甲酰氯溶液中；滴加完畢，升溫至80 ℃，反應2 h；旋干溶劑，加入碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯(EA)萃取2次，有機相用無水硫酸鈉干燥，旋干，經(jīng)柱層析純化，流動相為石油醚(PE)-EA(體積比5∶1)，得白色固體中間體Ⅰa 2.3 g。

1.2.2.2 中間體Ⅰb的合成

將2-氨基-6-甲基苯甲酰氯6.0 g(35.3 mmol)加入到50 mL 無水四氫呋喃中，冰浴降溫到0 ℃，氮氣保護；將4-氟-2-甲基苯胺4.4 g(33.1 mmol)溶于10 mL無水四氫呋喃中，滴加到2-氨基-6-甲基苯甲酰氯溶液中；滴加完畢，升溫至80 ℃，反應2 h；旋干溶劑，加入碳酸氫鈉溶液和EA萃取2次，有機相用無水硫酸鈉干燥，旋干，經(jīng)柱層析純化，流動相為PE-EA(體積比5∶1)，得白色固體中間體Ⅰb 4.0 g。

1.2.2.3 中間體Ⅰc的合成

將2-氨基-6-甲基苯甲酰氯6.0 g(35.3 mmol)加入到50 mL 無水四氫呋喃中，冰浴降溫到0 ℃，氮氣保護；將5-氟-2-甲基苯胺4.4 g(33.1 mmol)溶于10 mL無水四氫呋喃中，滴加到2-氨基-6-甲基苯甲酰氯溶液中；滴加完畢，升溫至80 ℃，反應2 h；旋干溶劑，加入碳酸氫鈉溶液和EA萃取2次，有機相用無水硫酸鈉干燥，旋干，經(jīng)柱層析純化，流動相為PE-EA(體積比5∶1)，得白色固體中間體Ⅰc 3.5 g[10-11]。

1.2.3 中間體Ⅱ的合成

1.2.3.1 中間體Ⅱa的合成

取中間體Ⅰa 1.37 g(5.7 mmol)加入到5 mL乙酸中，再加入氯乙酰氯1.36 mL(17.1 mmol)，攪拌升溫至120 ℃，反應1 h；加入水和EA萃取2次，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌1次，無水硫酸鈉干燥，旋干，經(jīng)柱層析純化，流動相為PE-EA(體積比10∶1)，得白色固體中間體Ⅱa 200 mg。

1.2.3.2 中間體Ⅱb的合成

取中間體Ⅰb 3.5 g(13.6 mmol)加入到20 mL乙酸中，再加入氯乙酰氯3.19 mL(40.8 mmol)，攪拌升溫至120 ℃，反應1 h；加入水和EA萃取2次，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌1次，無水硫酸鈉干燥，旋干，經(jīng)柱層析純化，流動相為PE-EA(體積比10∶1)，得白色固體中間體Ⅱb 900 mg。

1.2.3.3 中間體Ⅱc的合成

取中間體Ⅰc 3.0 g(11.6 mmol)加入到18 mL乙酸中，再加入氯乙酰氯2.73 mL(34.8 mmol)，攪拌升溫至120 ℃，反應1 h；加入水和EA萃取2次，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌1次，無水硫酸鈉干燥，旋干，經(jīng)柱層析純化，流動相為PE-EA(體積比10∶1)，得白色固體中間體Ⅱc 800 mg。

1.2.4 目標化合物的合成

1.2.4.1 目標化合物Ⅲa的合成

取中間體Ⅱa 200 mg、2-氟-6-氨基嘌呤154 mg(1.5 eq.)，加入乙腈10 mL、DMF 5滴、碳酸鉀140 mg(1.5 eq.)，升溫至65 ℃，反應6 h，TLC監(jiān)測反應完全；旋干乙腈，加入水，攪拌過濾，固體拌樣經(jīng)柱層析純化，得白色固體化合物Ⅲa 180 mg。

1.2.4.2 目標化合物Ⅲb的合成

取中間體Ⅱb 900 mg、腺嘌呤577 mg(1.5 eq.)，加入乙腈30 mL、DMF 10滴、碳酸鉀589 mg(1.5 eq.)，升溫至65 ℃，反應6 h，TLC監(jiān)測反應完全；旋干乙腈，加入水，攪拌過濾，固體拌樣經(jīng)柱層析純化，得白色固體化合物Ⅲb 850 mg。

1.2.4.3 目標化合物Ⅲc的合成

取中間體Ⅱc 900 mg、腺嘌呤577 mg(1.5 eq.)，加入乙腈30 mL、DMF 10滴、碳酸鉀589 mg(1.5 eq.)，升溫至65 ℃，反應6 h，TLC監(jiān)測反應完全；旋干乙腈，加入水，攪拌過濾，固體拌樣經(jīng)柱層析純化，得白色固體化合物Ⅲc 910 mg。

1.3 目標化合物的抗腫瘤活性評價

分別稱取60 mg IC-87114原藥、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc，加入1 mL聚乙烯、1 mL聚氧乙烯蓖麻油-95%酒精(體積比50∶50)溶解，即得濃度為30 mg·mL-1的樣品母液，室溫避光貯存。實驗時將樣品母液用蒸餾水稀釋至3 mg·mL-1。

將原代培養(yǎng)的小鼠結腸癌細胞CT-26按濃度5×106個/100 μL接種于小鼠的右側肋部皮下，共接種20只小鼠；待腫瘤長至102.17 mm3時，將小鼠隨機分為5組，每組4只，分別給予IC-87114原藥、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc樣品母液，以溶劑組作為空白對照，觀察腫瘤體積，評價抗腫瘤活性。

2 結果與討論

2.1 結構表征

中間體Ⅰa：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:9.76(s,1H),7.44(d,J=7.8 Hz,1H),7.21(dd,J=26.2 Hz、7.1 Hz,2H),7.13(d,J=7.4 Hz,1H),6.98(t,J=7.7 Hz,1H),6.58(d,J=8.0 Hz,1H),6.46(d,J=7.4 Hz,1H),4.97(s,2H),2.32(s,3H),2.27(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+241。

中間體Ⅰb：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:9.76(s,1H),7.46(dd,J=8.5 Hz、5.8 Hz,1H),7.11(d,J=9.6 Hz,1H),7.06～7.00(m,1H),6.98(d,J=7.6 Hz,1H),6.59(d,J=8.0 Hz,1H),6.46(d,J=7.4 Hz,1H),4.98(s,2H),2.31(s,3H),2.28(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+259。

中間體Ⅰc：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:9.84(s,1H),7.48(d,J=10.5 Hz,1H),7.25(t,J=7.4 Hz,1H),7.04～6.92(m,2H),6.58(d,J=8.0 Hz,1H),6.46(d,J=7.3 Hz,1H),5.03(s,2H),2.30(s,3H),2.25(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+259。

中間體Ⅱa：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:7.39～7.76(m,7H),4.28(dd,J=55.8 Hz、12.1 Hz,2H),2.74(s,3H),2.07(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+299。

中間體Ⅱb：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:7.76(t,J=7.8 Hz,1H),7.60(d,J=8.1 Hz,1H),7.55～7.49(m,1H),7.39(d,J=7.4 Hz,1H),7.34(d,J=9.5 Hz,1H),7.24(t,J=8.1 Hz,1H),4.35(d,J=12.3 Hz,1H),4.27(d,J=12.3 Hz,1H),2.74(s,3H),2.08(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+317。

中間體Ⅱc：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:7.78(t,J=7.6 Hz,1H),7.63(d,J=7.9 Hz,1H),7.49(d,J=8.8 Hz,2H),7.42(d,J=7.0 Hz,1H),7.37(d,J=7.2 Hz,1H),4.40(d,J=12.4 Hz,1H),4.31(d,J=12.4 Hz,1H),2.77(s, 3H),2.07(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+317。

目標化合物Ⅲa：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:8.05(s,1H),7.78(s,2H),7.62(s,1H),7.48(d,J=22.8 Hz,4H),7.28(dd,J=44.8 Hz、6.0 Hz,2H),5.05(d,J=17.3 Hz,1H),4.69(d,J=17.0 Hz,1H),2.73(s,3H),2.16(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+416。

目標化合物Ⅲb：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:8.06(d,J=10.9 Hz,2H),7.62(t,J=7.7 Hz,1H),7.55(s,1H),7.39(d,J=8.9 Hz,1H),7.34～7.27(m,2H),7.24(m,3H),5.10(d,J=17.3 Hz,1H),4.81(d,J=17.3 Hz,1H),2.73(s,3H),2.16(s, 3H);LC-MS,m/z:[M+H]+416。

目標化合物Ⅲc：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:8.06(d,J=9.9 Hz,2H),7.62(t,J=7.7 Hz,1H),7.57～7.46(m,2H),7.38～7.30(m,2H),7.24(d,J=7.4 Hz,3H),5.17(d,J=17.3 Hz,1H),4.81(d,J=17.3 Hz,1H),2.73(s,3H),2.13(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+416。

2.2 抗腫瘤活性

分別給予結腸癌小鼠IC-87114原藥、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc樣品母液，觀察腫瘤體積，結果如圖2所示。

圖2 結腸癌小鼠腫瘤體積變化

由圖2可知，IC-87114原藥、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc對結腸癌小鼠腫瘤生長的抑制效果均明顯優(yōu)于空白對照組；目標化合物Ⅲa的抑制效果整體優(yōu)于IC-87114原藥以及目標化合物Ⅲb、Ⅲc。初步證實，篩選得到的目標化合物Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc均能明顯抑制結腸癌小鼠腫瘤生長，且目標化合物Ⅲa的抑制效果整體較IC-87114原藥的更為明顯，可進行深入研究。

3 結論

通過對PI3Kδ抑制劑IC-87114的結構進行氟原子取代改造，得到3種氟原子取代位置不同的含氟嘌呤喹唑啉酮類PI3Kδ抑制劑Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc。通過結腸癌小鼠腫瘤體積增長實驗發(fā)現(xiàn)，合成的PI3Kδ抑制劑均具有抗腫瘤活性，且Ⅲa的抑制效果整體較IC-87114原藥的更為明顯。