張洋，呂君，陳尚周，雷淑英

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

過度暴曬、曬傷病史常與惡性皮膚癌的發(fā)生率增加有關(guān)，皮膚癌在白種人群中是較為常見的惡性腫瘤，每年全世界新增300 萬的非黑色素瘤皮膚癌患者[1]。非黑色素瘤皮膚癌發(fā)病率的增加，迫切需求開發(fā)新的治療方法、預(yù)防措施，以及優(yōu)化診斷。非黑色素瘤皮膚癌起源于角質(zhì)形成細胞，根據(jù)腫瘤發(fā)生的細胞類型可分為基底細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）[2-3]。已有研究指出，生長因子及其受體表達失調(diào)對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著重要影響[4]，其中表皮生長因子受體（EGFR）在CSCC 中起著關(guān)鍵作用[5]。EGFR 在人表皮中廣泛表達，調(diào)節(jié)表皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細胞增殖、分化和細胞死亡等過程[6]。

富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域2（LRIG2）屬于一種跨膜蛋白，在整個表皮中均有表達，參與受體酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)，如EGFR 受體[7]。LRIG2 可促進EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作為膠質(zhì)母細胞瘤細胞的正反饋回路，提示LRIG2 是一種促癌基因[8]。近期研究表明，LRIG2 可通過激活EGFR 信號通路增加CSCC 的癌變過程[9]。

Qu 是黃酮類化合物，主要分布在蕨類植物、裸子植物及被子植物中，有較強的抗腫瘤活性[10]。已有研究證實Qu 對輻射誘導(dǎo)的皮膚纖維化有保護作用[11]。然而，Qu 對CSCC 細胞的增殖是否有抑制作用，尚未見報道。因此，本實驗觀察Qu 對A431 細胞增殖、凋亡及LRIG2/EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。

1 材料及方法

1.1 一般資料

1.1.1 材料及試劑 A431 細胞株來源于上海ATCC 細胞庫；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司；CCK8 試劑盒購自Solarbio 公司，批號40203ES60；RIPA 裂解液購自杭州四季青公司，批號SB203580；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)，批號H20000337；Annexin V/FITC 細胞凋亡試劑盒購自北京四正柏生物公司，批號KGA107；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3/9 活性檢測試劑盒購自Solarbio 公司，批號C10268951；兔抗鼠Bax（批號ab1098963）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2，批號ab0983652）、LRIG2（批號ab02764633）、EGFR（批號ab2019874）、p-EGFR（批號ab0023876）及β-actin（批號ab1829095）抗體購自英國Abcam公司；羊抗兔IgG 二抗（上海谷歌生物公司）；ELC化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Advansta）。

1.1.2 主要儀器 BIORAD-550 型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；BBS-V800 型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）；SPX-250 型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；GE-100 型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；Amersham Imager 600 儀器（BIO-RAD，美國）；FACSCalibur 型流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司）。

1.2 方法

1.2.1 A431 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清和1%抗生素的的DMEM 培養(yǎng)基對A431 細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5%二氧化碳（CO2）、37 ℃恒溫。待細胞融合至90%左右時，便進行傳代培養(yǎng)。首先磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2 遍，加入胰蛋白酶進行消化細胞，待細胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至EP 離心管，1 000 r/min（離心半徑20 cm）離心5 min，棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK8 實驗 將對數(shù)期A431 細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)過夜，然后加入10～200 μg/mL 的Qu 處理細胞12、24、48、72 h 后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 含10 μL 的CCK8 試劑的DMEM 培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測細胞吸光度OD 值，并計算細胞相對活力。計算公式如下：細胞相對活力（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.3 細胞克隆數(shù)分析 將對數(shù)期A431 細胞接種于6 孔板，每孔1 000 個細胞，培養(yǎng)過夜，然后加入10～200 μg/mL 的Qu 處理細胞6 d 后，每2 d 更換1次含藥的新鮮培養(yǎng)液；然后對克隆細胞進行染色并計數(shù)。

1.2.4 5-溴-2-脫氧脲苷試劑（BrdU）ELISA 實驗 將對數(shù)期A431 細胞接種于96 孔板，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)過夜；10～200 μg/mL 的Qu 處理細胞48 h 后，加入BrdU 試劑孵育12 h；再采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測BrdU 偶聯(lián)的細胞，并在酶標(biāo)儀405 nm 處測定其吸光度OD 值。

1.2.5 流式細胞術(shù) 收集各組細胞，PBS 清洗2 次，采用2.0 mg/mL 的PI 染液和RNaseⅠ染色30 min，流式細胞儀立即檢測細胞周期分布情況。另外，收集細胞，PBS 重懸后，分別加入Annexin-V FITC 和PI 處理細胞（按照試劑盒操作說明書進行），最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 Western blot 實驗 收集各組細胞，每組加入200 μL 的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細胞裂解液，4 ℃條件下12 000 r/min（離心半徑為20 cm）離心12 min，收集上清。BCA 法檢測了上清中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg 進行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后在恒流275 mA 條件下電轉(zhuǎn)70 min，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，將目的條帶放入對應(yīng)的一抗溶液（稀釋比1∶1 000）中，4 ℃搖床孵育過夜。洗膜緩沖液（TBST）洗膜3 次，10 min/次，再把條帶放入盛二抗（稀釋比1∶3 000）的平皿中室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次。加入4 mL 的ECL 顯影液顯色3 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.2.7 Caspase-3/9 活性試驗 收集各組細胞，采用Caspase-glot-3/9 活性測定試劑盒檢測Caspase-3/9活性，酶標(biāo)儀在405 nm 處測定其吸光度值。

1.2.8 LRIG2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 LRIG2 mimics 和LRIG2 inhibitor 質(zhì)粒由武漢巴菲爾生物有限公司合成，序列分別為：5’-CTGGACAGTGTGTTTGA-3’，5’-CCUCAGAGUUCACGGACAU-3’。采用Lipofectamine 2 000 試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至A431 細胞，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Qu 對A431 細胞增殖活性的影響 Qu 對A431 細胞活力影響見圖1a，發(fā)現(xiàn)濃度高于50 μg/mL的Qu 處理細胞48 h 和72 h 時，細胞活力相比于0 μg/mL 的Qu 組明顯降低（P＜0.05）。Qu 對A431 細胞克隆的影響見圖1b，提示濃度＞50 μg/mL 的Qu處理細胞48 h 時，細胞克隆數(shù)相比于0 μg/mL 的Qu 組明顯降低（P＜0.05）。Qu 對BrdU 偶聯(lián)細胞數(shù)的影響見圖1c，提示濃度高于50 μg/mL 的Qu 處理細胞48 h 時，BrdU 偶聯(lián)細胞數(shù)相比于0 μg/mL 的Qu組明顯降低（P＜0.05）。另外，流式細胞術(shù)檢測A431細胞周期分布如圖1 d，100 μg/mL 的Qu 處理細胞48 h，G1期細胞數(shù)明顯增高，而S 和G2期細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。

圖1 Qu 對A431 細胞增殖的影響

2.2 Qu 多A431 細胞凋亡的影響 Qu 對A431 細胞中凋亡相關(guān)蛋白影響見圖2a、b，發(fā)現(xiàn)Qu 能明顯誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax 表達，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達（P＜0.05）。Qu 對凋亡蛋白Caspase-3/9 活性影響見圖2c，提示Qu 能明顯誘導(dǎo)Caspase-3/9 活性增高（P＜0.05）。另外，流式細胞術(shù)檢測A431 細胞凋亡率見圖2d，濃度高于50 μg/mL 的Qu 處理細胞48 h時，細胞凋亡率相比于0 μg/mL 的Qu 組明顯升高（P＜0.05）。

圖2 Qu 對A431 細胞凋亡的影響

2.3 Qu 對A431 細胞中LRIG2/EGFR 信號通路的影響 100 μg/mL 的Qu 處理細胞48 h 時，相比于0 μg/mL 的Qu 組LRIG2 和p-EGFR 表達水平明顯降低（P＜0.05）；然而，EGFR 表達水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化（P＞0.05），見圖3。

圖3 Qu 對LRIG2/EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

2.4 EGFR 激動劑NSC228155 對A431 細胞生長的影響 Qu 與NSC 228155 共同處理A431 細胞48 h，對細胞活力和凋亡率檢測結(jié)果見圖4。提示Qu+NSC 228155 組細胞活力相比于Qu 組顯著增高，而細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

圖4 NSC 228155 對A431 細胞生長的影響

2.5 Qu 通過LRIG2 誘導(dǎo)A431 細胞凋亡 LRIG2 mimics 和LRIG2 inhibitor 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431 細胞，可分別上調(diào)和沉默LRIG2 基因表達，見圖5a、b。相比于Qu 組，Qu+LRIG2 mimics 組p-EGFR 表達水平明顯升高，細胞活力明顯升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；Qu+LRIG2 inhibitor 組p-EGFR 表達水平明顯降低，細胞活力明顯降低，細胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。相比于對照組，Qu+LRIG2 mimics 組p-EGFR 表達水平明顯降低，細胞活力明顯降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；Qu+LRIG2 inhibitor 組p-EGFR 表達水平明顯降低，細胞活力明顯降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖5c～f。3 討論

圖5 Qu 通過LRIG2 調(diào)節(jié)A431 細胞生長

Qu 有抗腫瘤的藥理活性，表現(xiàn)出抑制癌細胞生長、誘導(dǎo)其凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。然而，相關(guān)作用機制尚不清楚。Qu 有多種抗癌特性，包括調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)、促凋亡、抗增殖、抗氧化及抑制生長等。事實上，現(xiàn)在學(xué)者們已經(jīng)知道Qu 有多種生物學(xué)效應(yīng)，抑制多種酶參與細胞增殖以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。另一方面，也有研究報告，當(dāng)Qu 聯(lián)合化療藥物或放射治療對多種癌癥都表現(xiàn)出潛在的協(xié)同效應(yīng)，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌等[12]。于是，該實驗主要目的是闡述Qu 對體外培養(yǎng)的A431 細胞凋亡的誘導(dǎo)機制。實驗結(jié)果提示，Qu 可抑制A431 細胞增殖，促使其凋亡；降低LRIG2 表達，抑制EGFR 磷酸化；Qu通過介導(dǎo)LRIG2/EGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)A431 細胞凋亡。腫瘤發(fā)生機制研究已證實細胞凋亡是藥物化療或放療的結(jié)果，由信號網(wǎng)絡(luò)基因的表達異常參與此過程。細胞凋亡途徑包括死亡受體途徑及線粒體途徑，均能進一步活化Caspase-3，引發(fā)內(nèi)切核酸酶活化，導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生[12-13]。Caspase 是調(diào)控細胞凋亡的主要蛋白，主要通過抑制Caspase-3 和Caspase-9活性阻斷細胞的凋亡，并且這些蛋白的表達水平與CSCC 的增殖、凋亡相關(guān)密切[14-15]。本研究揭示Qu 能明顯增強Caspase-3/9 活性、增高促凋亡蛋白Bax表達及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，進而誘導(dǎo)A431細胞凋亡。

本課題進一步探討了Qu 誘導(dǎo)A431 細胞凋亡的分子機制。LRIG2 蛋白是不同受體酪氨酸激酶的重要調(diào)節(jié)因子，參與EGFR 受體家族的正負反饋循環(huán)[16]。LRIG2 是一種促癌蛋白，其表達水平增高與宮頸鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌和膠質(zhì)母細胞瘤的預(yù)后不良有關(guān)[17-19]。另外，LRIG2 在CSCC 細胞中表達水平明顯上調(diào)，與促使了皮膚的癌變過程[9]。與上述研究結(jié)果類似，本實驗發(fā)現(xiàn)Qu 降低LRIG2 表達水平，進而誘導(dǎo)A431 細胞凋亡。

EGFR 表達失調(diào)對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著重要影響，包括CSCC[5]。EGFR 在人表皮中廣泛表達，調(diào)節(jié)表皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細胞增殖、分化和細胞死亡等過程[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)Qu 可抑制EGFR 磷酸化水平，進而降低A431 細胞增殖活性。采用EGFR 激動劑與Qu 共處理A431 細胞時，發(fā)現(xiàn)其可部分逆轉(zhuǎn)Qu對A431 細胞的毒性作用，說明Qu 通過EGFR 信號通路發(fā)揮抗CSCC 的作用。實驗進一步觀察LRIG2關(guān)鍵蛋白的樞紐作用，對LRIG2 基因進行過表達和沉默，發(fā)現(xiàn)LRIG2 基因過表達會部分逆轉(zhuǎn)Qu 對EGFR 磷酸化的抑制作用及A431 細胞的毒性作用，提示Qu 是通過LRIG2/EGFR 信號通路發(fā)揮抗CSCC 的藥理活性。

綜上所述，Qu 可通過誘導(dǎo)A431 細胞凋亡和抑制細胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用，其機制可能與抑制LRIG2/EGFR 信號通路活化有關(guān)。