郭晨琪，申倩，張浩月，馬叢，張宇

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

蕁麻疹是由于皮膚、黏膜小血管擴張及滲透性增加而出現(xiàn)的一種局限性水腫反應，臨床上表現(xiàn)為大小不等的風團并伴有瘙癢，約有20%患者同時出現(xiàn)血管性水腫[1]。蕁麻疹在中醫(yī)學上稱為“癮疹”、“風騷癢”、“游風”等[2]。對于蕁麻疹的治療，西醫(yī)采取對癥施治，及時脫敏和使用抗組胺藥物，中醫(yī)則是根據(jù)辨證論治原則，口服中藥湯劑調(diào)治，同時配合針灸等獨特療法，對于治療蕁麻疹有明顯成效[3]。

皮炎1 號方為天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，加減化裁于名方荊防湯，適用于泛發(fā)性急性皮炎或風團皮膚病，包括丘疹狀濕疹、嬰兒濕疹、屈側濕疹、下肢濕疹、泛發(fā)性神經(jīng)性皮炎、瘙癢證、急性蕁麻疹、丘疹狀蕁麻疹、玫瑰糠疹和多形性紅斑等，在臨床上取得了很好的療效。

中藥網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)水平上的中藥藥效學和中醫(yī)藥基礎理論的聯(lián)合，幫助醫(yī)者們從分子、靶點、網(wǎng)絡等多水平、多角度、可視化分析中藥的活性成分及其對疾病產(chǎn)生的生物學效力[4]。本研究借助網(wǎng)絡藥理學，深入挖掘皮炎1 號方治療蕁麻疹的作用機制，為臨床用藥提供科學支持，為中藥現(xiàn)代化提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選皮炎1 號方的活性化合物和靶點 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）數(shù)據(jù)庫中分別檢索荊芥、防風、連翹等11 味中藥，得到每味中藥的化學成分，其中生石膏、蟬衣未能找到相應化合物及靶點，故略去。根據(jù)口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Druglikeness，DL）≥0.18 的屬性值對檢索到的所有化學成分進行篩選，收集到皮炎1 號方的活性化合物。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找化合物的作用靶點，根據(jù)已發(fā)表的文獻對藥物靶點進行補充。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中，將已知藥物靶點蛋白轉化為靶基因。

1.2 篩選疾病的高關聯(lián)度靶點 在GeneCards、OMIM、PharmGkb 和TTD 數(shù)據(jù)庫中檢索關鍵詞“Urticaria”，篩選出疾病高關聯(lián)度靶點。在Excel 表中進行去重，得到最終的疾病靶點庫。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將最終得到的基因靶點轉化為靶基因。

1.3 疾病-化合物共同靶點的篩選 利用VennPainter軟件，將皮炎1 號方活性化合物的作用靶點與疾病靶點取交集，篩選出二者共同的作用靶點。

1.4 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡的構建 將皮炎1號方中化合物、疾病以及二者的共同靶點蛋白上傳至Cytoscape 軟件（http：//www.cytoscape.org/）生成體現(xiàn)藥物-共同靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡（PPI） 的構建 利用String（https：//string-db.org/）蛋白互作數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析共同靶點蛋白之間的相互作用，選擇高相關性，并用R 語言進行計數(shù)分析。

1.6 基因本體（GO）功能富集分析 利用Cytoscape軟件對共同靶點蛋白進行GO 功能富集分析，以了解共同靶點蛋白在基因功能中的作用，通過Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com/tools/index，php/）對結果進行可視化處理。

1.7 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用David（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件將共同靶點進行KEGG 通路富集分析，對共同靶點蛋白在信號通路中的作用做注釋分析，得到皮炎1 號方治療蕁麻疹的信號通路，通過Omicshare 軟件對結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 皮炎1 號方化合物及作用靶點的篩選 利用TCMSP 分別查找皮炎1 號方中9 味中藥的化合物及作用靶點，以“OB≥30%，DL≥0.18”為條件經(jīng)過整理發(fā)現(xiàn)，皮炎1 號方中活性化合物共有124 種。查找皮炎1 號方中化合物的靶點，經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫基因注釋后，篩選得到134 個靶點。

2.2 疾病靶點及藥物-疾病共同靶點的確定 利用Genecards、OMIM、PharmGkb 以及TTD 疾病數(shù)據(jù)庫經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫基因注釋后，去除重復靶點，共篩選出999 個疾病靶點。與134 種化合物的靶點映射，利用VennPainter 軟件，分析得出皮炎1 號方與蕁麻疹的共同靶點有36 個，見圖1。

圖1 藥物疾病共同靶點韋恩圖

2.3 “藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡”的構建與分析 利用Cytoscape 繪制的皮炎1 號方治療蕁麻疹的“藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡”網(wǎng)絡圖，見圖2。該圖包括171 個節(jié)點，其中疾病節(jié)點1 個（黃色），方劑節(jié)點1個（橙色），中藥節(jié)點9 個（綠色），靶點基因節(jié)點36個（紅色），活性成分節(jié)點124 個（藍色）。通過分析發(fā)現(xiàn)皮炎1 號方中最主要的前3 種活性成分為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇。分析靶點節(jié)點度值較高的前3 個靶基因為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶、毒蕈堿型膽堿受體M、乙酰膽堿酯酶，提示這些基因可能是皮炎1 號方治療蕁麻疹的核心靶點。

圖2 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡的構建與分析 利用String 蛋白互作數(shù)據(jù)庫和C 語言分析共同靶點蛋白之間的相互關系，見圖3。利用R 語言對PPI 中每個蛋白之間的相互關系進行計數(shù)，見圖4。相互關系最多的蛋白前3位分別為白細胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）。

圖3 PPI 圖

圖4 PPI 核心蛋白柱狀圖（前30 個）

2.5 GO 功能富集分析 對皮炎1 號方與蕁麻疹的共同靶點進行GO 功能富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05 為標準，確認了1 243 條結果，利用Omicshare 軟件對結果進行可視化處理，展示前30個共同的基因功能，見圖5，分別是對抗生素的反應、細胞對異物的反應、對金屬離子的反應、G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路、對糖皮質(zhì)激素的反應、對脂多糖的反應、對細菌源分子的反應、對皮質(zhì)類固醇的反應、對缺氧的反應、對氧水平降低的反應、乙酰膽堿受體信號通路、對氧水平的反應、對乙酰膽堿的反應、細胞對乙酰膽堿的反應、對異型生物質(zhì)的反應、對鐵離子的反應、細胞對藥物的反應、G 蛋白偶聯(lián)血清素受體信號通路、外源性凋亡信號通路、突觸后信號傳導。

圖5 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 對皮炎1 號方和蕁麻疹的共同靶點利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 通路富集分析，以P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05 進行篩選，并將結果利用Omicshare 軟件可視化。共涉及92 條信號通路，展示前30 個信號通路，見圖6。主要包括前列腺腫瘤、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、腫瘤中的蛋白多糖，磷脂酰肌醇-3 激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號通路、抗藥性、p53 信號通路、人類皰疹病毒（EB）感染、人巨細胞病毒感染、腫瘤中的MicroRNA、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、突觸膽堿能、胰腺癌、膀胱癌、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥、細胞凋亡、結腸癌、麻疹病毒、流體剪切損傷、軍團菌病、子宮內(nèi)膜癌、乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性心肌炎、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、甲型流感、弓形蟲病、非小細胞肺癌、多物種凋亡和非洲錐蟲病。

圖6 KEGG 通路富集分析

3 討論

蕁麻疹是一種由肥大細胞驅動的常見疾病，表現(xiàn)為風團或血管性水腫或二者均有，其發(fā)病機制尚不完全明確，但普遍認為是IgE 介導的肥大細胞活化脫顆粒，釋放以組胺為主的炎性介質(zhì)是蕁麻疹發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)[5]。最近的研究集中在嗜堿性粒細胞在蕁麻疹中的作用上，在蕁麻疹患者的血清中檢測到IL-31 水平升高，而IL-31 由嗜堿性細胞釋放，可能刺激嗜堿性細胞趨化并激活IL-4 和IL-13 的釋放[6]。有研究表明蕁麻疹患者嗜堿性細胞上CD63 的表達增加與過敏致敏、血清自身反應和嗜堿性細胞反應相關[7]。

皮炎1 號方的現(xiàn)代藥理學研究表明，本方荊芥、防風都有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、影響機體免疫功能等作用[8-9]。黃芩中的化合物黃芩素，能顯著抑制炎性因子IL-6和TNF-α 的釋放以及炎性介質(zhì)前列素（PG）E2 和一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，且呈良好劑量依賴關系[10]。黃芩苷有明顯的抗氧化的效果，有研究結果顯示黃芩苷可以通過促進內(nèi)皮依賴性血管舒張和抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的細胞凋亡改善內(nèi)皮功能受損，其中黃芩苷能降低Caspase-3 的表達，并增加B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的表達[11]。苦參中的苦參堿，可通過抑制磷脂酶A2 和環(huán)氧化酶抑制炎性介質(zhì)前列腺素生物合成以及抑制花生四烯酸轉化成白三烯，也可通過穩(wěn)定細胞膜抑制肥大細胞釋放組胺和直接競爭組胺H1 受體，產(chǎn)生抗炎作用[12]。白鮮皮提取物有止癢的效果[13]。叢歡等[14]在研究白鮮皮提取物對致癢閾值的影響過程中發(fā)現(xiàn)，白鮮皮提取物能顯著提高豚鼠局部致癢閾值，白鮮皮提取物高、中劑量組對組胺致豚鼠局部瘙癢有一定的抑制作用。

由“中藥-化合物-靶點”網(wǎng)絡可知槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是皮炎1 號方主要的前3 種活性成分，協(xié)同作用于多個靶點發(fā)揮對蕁麻疹的治療作用。槲皮素有抗病毒、抗氧化、抗輻射作用，可通過抑制組胺釋放、降低嗜酸性粒細胞百分比和減少肥大細胞脫顆粒，而緩解血管擴張[15]，還可通過抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）和抗IgE 抑制Ⅰ型變態(tài)反應[16]。山奈酚可顯著降低脂多糖誘導的胎膜促炎細胞因子（IL-6 和IL-8）和PGE2 和PGE2α 的分泌，可用來預防炎性反應并減少其損害[17]。β-谷甾醇能抑制炎性細胞的浸潤以抑制血清中IgE、IL-4 和組胺的產(chǎn)生，并在不同類型的急性炎性反應中有顯著的抗炎能力，通過控制炎性細胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)免疫功能[18]。

根據(jù)PPI 圖可知皮炎1 號方和蕁麻疹共同靶點相互關系最多的前3 位蛋白分別為IL-6、VEGFA、Caspase-3。IL-6 被證明是一種原型細胞因子，對炎性、免疫反應和造血功能有多效作用，并通過刺激抗體產(chǎn)生并誘導幼稚CD4＋的分化，在獲得性免疫應答中也起重要作用[19]。IL-6 可以以信號轉導與轉錄激活因子（STAT3）依賴性方式增強免疫球蛋白受體（FcεRI）誘導的COX-2 表達、前列腺素D-2（PGD-2）生物合成和VEGF 的產(chǎn)生，并通過促進組織內(nèi)肥大細胞產(chǎn)生炎性PGD-2 而參與人類過敏性疾病[20]。PI3K 參與內(nèi)皮細胞微管的形成，也參與內(nèi)皮細胞增殖、存活、遷移和血管通透性的形成[21]。

通過GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，皮炎1 號方治療蕁麻疹篩選出的核心蛋白主要發(fā)生在BP 環(huán)節(jié)，如對氧氣水平的反應、對類固醇激素的反應、對糖皮質(zhì)激素的反應和皮質(zhì)類固醇反應等。KEGG 通路富集涉及多條抗蕁麻疹關鍵通路，包括PI3K-AKT 信號通路、TNF 信號通路、p53 信號通路和HIF-1 信號通路等。研究發(fā)現(xiàn)蕁麻疹患者PI3K-AKT 和HIF-α 通路以IgE 依賴的方式誘導肥大細胞中VEGF 的產(chǎn)生，并使核因子-κB（NF-κB）的磷酸化和HIF-α 的表達水平增加，AKT 充當P13K 的下游調(diào)節(jié)劑，通過控制HIF-α 來調(diào)節(jié)VEGF 基因表達[22]。TNF 通路的失調(diào)是包括敗血癥，癌癥以及自身免疫和炎性疾病在內(nèi)的多種疾病的關鍵特征和致病因素[23]。蕁麻疹與TNF 信號通路的激活有關，其標志為sTNF-R1和sTNF-R2 的循環(huán)濃度升高，可能是該疾病全身炎性反應的一部分[24]。

綜上所述，皮炎1 號方中含有多種藥效成分可以從多個層面發(fā)揮對蕁麻疹的治療作用，每個有效成分均作用于多個靶點，且文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)大多核心靶點確實與蕁麻疹治療相關。此外，GO 和KEGG 富集分析有助于幫助醫(yī)者們進一步理解皮炎1 號方相關靶點蛋白參與表達的生物學通路，為后續(xù)進一步提高皮炎1 號方的安全性、有效性提供了科學依據(jù)，推動了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究發(fā)展。