唐蘇為，陸家睛，謝韶瓊，姜文成，賴競(jìng)思，楊伶俐，片山一朗，張慧敏

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院，上海 200443，2.大阪市立大學(xué)色素病癥治療共同開發(fā)部門，日本 大阪 5450051，3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201204）

白癜風(fēng)是一種獲得性慢性色素脫失性疾病，表現(xiàn)為局部表皮功能性黑素細(xì)胞選擇性喪失，全球患病率為0.5%～2%，本病易對(duì)患者造成極大的心理負(fù)擔(dān)，需要及時(shí)有效的治療[1]。白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與遺傳、免疫、神經(jīng)、生化和環(huán)境內(nèi)外因素有關(guān)。近年來越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激會(huì)引起黑素細(xì)胞的損傷和凋亡，是白癜風(fēng)發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)鍵因素[2]。因此，使用抗氧化劑來減少或逆轉(zhuǎn)表皮中的氧化應(yīng)激損傷從而恢復(fù)黑素細(xì)胞功能的治療策略已引起越來越多學(xué)者的研究興趣。人參皂苷化合物K（Compound K，CK）屬二醇型人參皂苷，其結(jié)構(gòu)為20（S）原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，見圖1，是人參皂苷在人腸道內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，并經(jīng)吸收入血成為人參皂苷在體內(nèi)的主要成分，也是人參發(fā)揮生物活性的主要成分，可從人參、三七等富含人參皂苷的中藥材中轉(zhuǎn)化獲得其單體化合物[3]。CK 的藥理作用主要包括抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌和神經(jīng)保護(hù)[4-7]等。在皮膚科領(lǐng)域，有研究證實(shí)CK 可用于對(duì)抗皮膚衰老、改善皮膚的整體狀況[8-9]。然而，對(duì)于CK 在黑素細(xì)胞中的作用，醫(yī)者們知之甚少。本研究通過使用H2O2誘導(dǎo)的來自新生兒中度色素沉著性包皮的正常人表皮黑素細(xì)胞（HEMn-MP）氧化應(yīng)激作為體外模型，探索CK 對(duì)經(jīng)氧化應(yīng)激損傷后的人黑素細(xì)胞的保護(hù)作用并闡明其潛在的分子機(jī)制，為探討CK 對(duì)白癜風(fēng)的治療作用提供理論依據(jù)。

圖1 CK 化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 HEMn-MP 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.1.2 試劑 人參皂苷CK（純度：＞98.0%，四川維科奇生物科技有限公司），M254 細(xì)胞培養(yǎng)基、人類黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑、溴化乙錠（EB）、Hoechst 33342（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），過氧化氫H2O2（日本W(wǎng)AKO 公司），二甲基亞砜（DMSO）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）比色試劑盒（美國(guó)Sigma公司），磷酸激酶抗體陣列檢測(cè)試劑盒（R&D system公司），胰蛋白酶（日本Nacalai Tesque 公司）、PBS緩沖液（日本Fujifilm Wako 公司）。

1.1.3 儀器 ImageQuant TL 圖像分析軟件（GE Healthcare 公司），自動(dòng)酶標(biāo)儀（550 型，美國(guó)Bio-Rad Laboratories 公司），共聚焦熒光顯微鏡（Keyence公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HEMn-MP 細(xì)胞，加入含1%人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑的M254 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第8～11 代細(xì)胞用于做本次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加藥刺激。

1.2.2 分組 共分3 組，空白對(duì)照組、0.4 mmol/L H2O2組、0.4 mmol/L H2O2+0.625 μg/mL CK 組。

1.2.3 磷酸激酶抗體陣列檢測(cè) 使用磷酸激酶抗體陣列檢測(cè)（ARY003B，R&D Systems）分析磷酸化激酶，根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)HEMn-MP 細(xì)胞各陣列蛋白磷酸化水平，每個(gè)陣列加入300 μg 蛋白質(zhì)裂解物，使用圖像分析軟件（ImageQuant TL，GE Healthcare）量化斑點(diǎn)的像素灰度值。

1.2.4 Caspase 3 活性檢測(cè) 使用比色試劑盒（CASP3C-1KT）測(cè)定Caspase-3 活性，根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)Caspase-3 活性。該試劑盒基于Caspase-3對(duì)Ac-DEVD-pNA 的水解，從而產(chǎn)生對(duì)硝基苯胺（pNA）部分。在405 nm（εmM=10.5）處檢測(cè)到pNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)或多因素方差分析用來比較各組之間的差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK 減弱H2O2誘導(dǎo)的HEMn-MP 細(xì)胞p53 蛋白磷酸化 磷酸激酶抗體陣列檢測(cè)結(jié)果顯示，在黑素細(xì)胞中使用H2O2刺激3 h 后，Ser15 和Ser46 處的p53 磷酸化顯著增加，并且其他p53 相關(guān)磷酸化位點(diǎn)沒有變化，而CK 預(yù)處理后減弱了H2O2誘導(dǎo)的Ser15 和Ser46 處p53 磷酸化，見圖2。

圖2 CK 對(duì)培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞p53 蛋白磷酸化的影響

2.2 CK 降低H2O2誘導(dǎo)的Caspase-3 活化 使用比色法測(cè)定HEMn-MP 細(xì)胞中的Caspase-3 活化，觀察到Caspase-3 在經(jīng)H2O2刺激后被激活、活性顯著增加，而在CK 預(yù)處理后Caspase-3 的活性則顯著降低，見圖3。

圖3 CK 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的Caspase-3 活化的影響

3 討論

氧化應(yīng)激是細(xì)胞過度產(chǎn)生或不充分清除活性氧分子的結(jié)果，其特點(diǎn)是自由基形成與身體抗氧化能力之間的不平衡，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等不同分子的非特異性損傷[10]。皮膚是人體身體最大的屏障器官，每天受紫外線輻射、空氣污染、病原體、化學(xué)物質(zhì)等侵襲，很容易引起皮膚中各類細(xì)胞的損傷[11]。皮膚在受到外源性刺激時(shí)可產(chǎn)生大量的氧自由基，當(dāng)自由基的產(chǎn)生超出機(jī)體清除能力時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，同時(shí)，細(xì)胞有氧代謝也會(huì)產(chǎn)生少量H2O2、HO-等活性氧自由基，越來越多的學(xué)者認(rèn)為白癜風(fēng)的發(fā)生與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，已有研究證實(shí)，在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮中可檢測(cè)到過量蓄積的H2O2[12]。由于黑色素合成過程中產(chǎn)生的促氧化狀態(tài)[13]，此外，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞趨化攻擊黑素細(xì)胞[14]，故皮膚中的黑素細(xì)胞特別容易受到氧化應(yīng)激的影響，尋找適合的抗氧化劑，通過針對(duì)性的抗氧化治療阻斷自身免疫攻擊、保護(hù)黑素細(xì)胞為白癜風(fēng)的治療提供了新的思路。中藥等是天然抗氧化劑的主要來源，實(shí)驗(yàn)證明多種中藥提取物可發(fā)揮抗氧化作用，安全性較高，在白癜風(fēng)的治療中有較好的應(yīng)用前景，此外，藥物化學(xué)提取技術(shù)的日趨進(jìn)步也為研究天然抗氧化化合物以改善氧化應(yīng)激相關(guān)的皮膚病鋪平了道路。

CK 作為人參和三七的主要成分人參皂苷的腸道代謝產(chǎn)物，被證實(shí)在多種氧化應(yīng)激相關(guān)條件下均能起到保護(hù)作用：CK 通過增加超氧化物歧化酶水平和谷胱甘肽過氧化物酶活性來改善肝臟抗氧化活性[15]；CK 通過顯著減少氧化應(yīng)激來預(yù)防腎病[16]；CK 通過對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)激活抗氧化應(yīng)激增強(qiáng)記憶力[17]。然而，CK 是否可以保護(hù)黑素細(xì)胞免受氧化應(yīng)激尚未見他人報(bào)道?；诖?，筆者進(jìn)行了前期研究，并且發(fā)現(xiàn)CK 可以保護(hù)人類黑色素細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[18]，為了探究其可能的分子機(jī)制，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)后，筆者采用HEMn-MP 細(xì)胞作為為研究對(duì)象，以H2O2作為誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷的因素，建立體外模擬氧化應(yīng)激的黑素細(xì)胞模型，研究了CK 對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起的黑素細(xì)胞凋亡的影響。

黑素細(xì)胞的過度氧化應(yīng)激會(huì)觸發(fā)內(nèi)在凋亡途徑并最終介導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]，p53 蛋白則被稱為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，p53 以“分子警察”的身份監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)過程，一旦細(xì)胞受損，p53 蛋白表達(dá)水平會(huì)很快升高，并抑制DNA 復(fù)制、刺激DNA 切除修復(fù)，p53 含有一系列絲氨酸（S）/蘇氨酸（T）磷酸化位點(diǎn)，p53 的磷酸化在調(diào)節(jié)其激活以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面起著關(guān)鍵作用[20]。根據(jù)本次研究磷酸激酶陣列檢測(cè)結(jié)果顯示，在黑素細(xì)胞中用H2O2刺激3 h后，Ser15 和Ser46 點(diǎn)位處的p53 磷酸化顯著增加，而其他p53 相關(guān)磷酸化位點(diǎn)則沒有變化，CK 預(yù)處理后則減弱了H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞Ser15 和Ser46處的p53 磷酸化。與此同時(shí)，筆者結(jié)合溴化乙錠（EB）和Hoechst 33342 染色來分析CK 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響，結(jié)果顯示用H2O2處理后死亡細(xì)胞的比例增加，而在CK 預(yù)處理后則死細(xì)胞比例有所減少。由于Caspase-3 是內(nèi)切蛋白酶家族的成員，被稱為細(xì)胞凋亡中的劊子手，并在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮核心作用[21]，因此，筆者測(cè)定了黑素細(xì)胞中的Caspase-3 活化的程度，觀察到Caspase-3 活性在H2O2誘導(dǎo)下被極大地觸發(fā)，而CK 預(yù)處理后則能使其活性降低。

綜上所述，CK 在減弱H2O2誘導(dǎo)的HEMn-MPs細(xì)胞凋亡方面有一定的潛力，CK 可以作為一種抗氧化劑為預(yù)防和治療白癜風(fēng)提供新的思路。