陳佳祺，張澤涵，孔維嘉，金琦，陳健鵬，王雪茜

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

中醫(yī)藥在我國廣泛應(yīng)用于銀屑病治療，可起到改善皮損及其他主客觀癥狀、減緩復(fù)發(fā)等作用。中藥蛇莓、白英是有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長的“免疫調(diào)節(jié)中藥”，常單獨(dú)或配伍治療銀屑病血熱證[1-2]。蛇莓始見于《名醫(yī)別錄》，現(xiàn)代常用于治療熱毒熾盛諸癥及腫瘤的治療，許遜哲等[3]基于集對分析療效曲線與偏聯(lián)系數(shù)分析認(rèn)為蛇莓是治療銀屑病血熱證的優(yōu)選藥物。白英為本經(jīng)中的上品藥，有清熱解毒，利濕消腫的功效常用于丹毒等熱性皮膚病證屬熱毒內(nèi)蘊(yùn)者[4]。王玉璽教授從“毒”論治銀屑病，認(rèn)為白英是治療“濕毒”之佳品[5]。白彥萍教授臨床喜用“蛇莓-白英”藥對，認(rèn)為其有較好的清熱解毒涼血之力，切中銀屑病“血分郁熱”的核心病機(jī)，為其經(jīng)驗(yàn)方祛銀顆粒、清熱涼血方[1-2]中重要組成。盡管二藥搭配運(yùn)用于銀屑病的治療中取得了不錯(cuò)的療效，但其作用機(jī)制尚待明確。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)憑借其“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建思想與中醫(yī)理論的“整體”觀念相符合，被廣泛用于中藥藥對、復(fù)方作用機(jī)制研究，特別在作用靶點(diǎn)預(yù)測方面起到重要作用。因此，筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選蛇莓-白英的活性成分，通過基因本體（GO）功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析等方法尋找其在治療銀屑病過程中的重要靶點(diǎn)，以探討其對治療銀屑病的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 篩選活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn) 以蛇莓（SHE MEI）為關(guān)鍵詞，從中藥分子作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在線分析平臺(tái)（Batman-TCM）數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中獲得其所有化學(xué)成分。把Score cutoff≥10 和P≥0.05 作為篩選條件，從而得到其活性成分及活性成分的作用靶點(diǎn)基因。以白英為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)上進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，分析所得文獻(xiàn)找出其主要化學(xué)成分。從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫中獲得其相關(guān)靶點(diǎn)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索不到的化學(xué)成分則先用Pubchem 數(shù)據(jù)庫獲得其化學(xué)式，然后在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中獲得其相關(guān)靶點(diǎn)。然后將靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)的人源的靶點(diǎn)基因名稱。

1.2 篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn) 以銀屑?。≒soriasis）為關(guān)鍵詞，在GeneCards 在線和OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索，從而獲得銀屑病相關(guān)的靶標(biāo)。

1.3 篩選藥物與疾病的共同靶點(diǎn)并繪制藥物-疾病相關(guān)網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用R 軟件，將1.1 中得出的藥物靶點(diǎn)基因與1.2 中得出的疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行篩選，得出藥物與疾病的共同靶點(diǎn)基因。 通過Cytoscape3.7.1 軟件，構(gòu)建蛇莓、白英藥對的化學(xué)成分、化學(xué)成分的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白基因、疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因的藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)核心基因的篩選 將1.3 中得到的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)基因上傳至STRING 在線分析平臺(tái)（https：//string-db.org/）上，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。并運(yùn)用R 軟件得出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.5 通路富集分析 先采用bioconductor 程序包中的clusterProfiler 包以及R 軟件找出藥物與疾病共同靶點(diǎn)蛋白的基因ID，然后運(yùn)用以上2 個(gè)軟件進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，并將其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 蛇莓-白英藥對的主要活性成分的篩選結(jié)果通過Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫以及中國知網(wǎng)CNKI 檢索的方式篩選出活性化合物17 個(gè)，其中6 個(gè)來自于蛇莓，11 個(gè)來自于白英，蛇莓、白英中含有的17 個(gè)化合物的基本信息，見表1。

表1 蛇莓、白英的活性化合物

2.2 活性成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)及藥物疾病共同靶點(diǎn) 從Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫得到蛇莓的靶點(diǎn)基因共37 個(gè)，其中1 個(gè)化合物無相關(guān)的靶點(diǎn)基因。通過TCMSP 以及Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫獲得白英的靶點(diǎn)基因共164 個(gè)，其中2 個(gè)化合物搜索不到與其相關(guān)的靶點(diǎn)基因。2 種藥物均有的靶點(diǎn)有9 個(gè)。通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)3 740 個(gè)。通過R 軟件篩選獲得蛇莓-白英藥對與銀屑病共同靶點(diǎn)有101 個(gè)，并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 藥物-疾病相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 運(yùn)用Cytoscape3.7.1 軟件繪制出藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中共包括118 個(gè)節(jié)點(diǎn)（1 個(gè)疾病、2 個(gè)藥物、14 個(gè)化合物、101 個(gè)靶點(diǎn)）和242 條邊。菱形節(jié)點(diǎn)代表研究的疾病，六邊形節(jié)點(diǎn)代表研究藥物，三角形節(jié)點(diǎn)代表活性化合物，橢圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 的構(gòu)建及分析 應(yīng)用STRING 在線分析平臺(tái)對藥物與疾病的共同靶點(diǎn)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中包含95 個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)，平均度值為18.0，見圖3。并應(yīng)用R 軟件篩選出其中度值最高的30 個(gè)基因作為該網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。見圖4。

圖3 PPI 圖

圖4 PPI 圖核心基因

2.5 GO 功能富集分析 運(yùn)用bioconductor 程序包中的clusterProfiler 包以及R 軟件對藥物與疾病的交集基因進(jìn)行GO 功能富集分析。篩選到P＜0.05 的GO 條目98 個(gè)，涉及脂肪酸、羧酸等有機(jī)酸結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、類固醇激素及激素受體結(jié)合等生物過程。按照P 由小到大排列的前20 條主要生物過程，見圖5。

圖5 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 運(yùn)用bioconductor 程序包中的clusterProfiler 包以及R 軟件對藥物與疾病的交集基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析。篩選到P＜0.05的KEGG 信號(hào)通路145 條。主要涉及表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑抵抗通路（EGFR-TKIs）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路及利什曼病、結(jié)直腸癌、卡波西肉瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、百日咳等疾病相關(guān)通路。按照P 由小到大排列的前20 條主要信號(hào)通路，見圖6。

圖6 KEGG 通路富集分析

3 討論

銀屑病是一種臨床常見的慢性自身免疫性皮膚疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。既往研究表明其發(fā)病與多基因、多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子相關(guān)，可因各種病原微生物感染而發(fā)病或加重。近年來，中醫(yī)藥對銀屑病作用機(jī)制的研究不斷深入，主要涉及包括輔助性T 細(xì)胞1（Th1）、Th2、Th17、Th22 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）細(xì)胞在內(nèi)的T 輔助細(xì)胞及其細(xì)胞因子的調(diào)控、角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖[6]。但對于具體方藥作用靶點(diǎn)與通路的預(yù)測有待進(jìn)一步研究。

涼血活血和清熱解毒是中醫(yī)藥治療進(jìn)展期銀屑病的常規(guī)治法[7]。蛇莓、白英功善清熱解毒和涼血消腫，是腫瘤科常用對藥。藥理研究表明，除了干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等抗腫瘤作用外，還有降低血管通透性、抑菌、抗血管新生、抗病毒等作用，在治療帶狀皰疹、炎性反應(yīng)等皮膚疾病方面有前景[8-10]。近來年，白彥萍等[1]、李锘等[2]常將這一藥對應(yīng)用于銀屑病的中醫(yī)治療，以期起到抗炎消腫、抑制鱗屑產(chǎn)生、減小紅斑面積的效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，蛇莓-白英藥對共有17 個(gè)有效成分（蛇莓6 個(gè)、白英11 個(gè)），對應(yīng)靶點(diǎn)164 個(gè)，其中與銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)101 個(gè)，GO 與KEGG 富集分析分別得到98 及145 條潛在相關(guān)信號(hào)通路，可推測蛇莓-白英對于銀屑病的治療效果與多靶點(diǎn)、多通路相關(guān)。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、分析、篩選得到IL-6、VEGFA、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子受體（EGFR）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）等30 個(gè)核心基因。上述研究表明蛇莓和白英治療銀屑病的作用與炎性反應(yīng)、表皮過度增殖、新生血管增生這3 個(gè)生物過程相關(guān)，這與銀屑病的發(fā)病機(jī)制相符[1]。

GO 功能富集分析顯示“蛇莓-白英”藥對治療銀屑病的機(jī)制與脂肪酸、羧酸等有機(jī)酸結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物過程有著密切的關(guān)系。既往研究表明IL-17、IL-23、IL-9、TNF-α 等細(xì)胞因子在銀屑病發(fā)病過程中有重要作用，可通過炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生理過程影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展[11]。蛇莓和白英2 種藥物有一定的增強(qiáng)免疫功能及抗炎活性作用，本研究表明其增強(qiáng)免疫與抗炎功能可能與影響細(xì)胞因子活性及細(xì)胞因子受體結(jié)合過程相關(guān)。另外，Baran 等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP1）和FABP4 可以作為新的銀屑病標(biāo)志物，可為銀屑病的治療提供新的靶點(diǎn)。由蕾等[14]認(rèn)為維甲酸可以通過作用于相關(guān)的特異性核受體而干擾角質(zhì)細(xì)胞的形成與分化，從而可以用于銀屑病的治療。銀屑病皮損皮膚中維甲酸受體顯示出異常的分布順序，可以導(dǎo)致銀屑病表皮中混亂的維甲酸信號(hào)和分化失調(diào)，可以用于解釋銀屑病皮損中出現(xiàn)的角化過度和角化不全?？梢钥闯?，脂肪酸等有機(jī)酸結(jié)合過程及核受體活性與銀屑病發(fā)生密切相關(guān)。本研究表明“蛇莓-白英”藥對治療銀屑病的機(jī)制很可能與上述生物過程有關(guān)。

KEGG 通路富集分析顯示“蛇莓-白英”藥對治療銀屑病的潛在通路有145 條。經(jīng)過相關(guān)文獻(xiàn)查筆者認(rèn)為其機(jī)制主要與VEGF 通路、IL-17 信號(hào)通路、EGFR-TKIs 等有關(guān)。

VEGF 通路信號(hào)通路與銀屑病皮膚炎性反應(yīng)有密切的關(guān)系。VEGF-A 是血管新生過程中VEGF 信號(hào)通路促進(jìn)基底膜分解的主要因子[15]，在銀屑病患者皮損中呈現(xiàn)高表達(dá)[16]。Helia 等[17]研究表明抗VEGF 能夠顯著降低銀屑病小鼠皮膚炎性反應(yīng)。韓林[18]研究表明，白英生物堿SA2 能夠通過破壞細(xì)胞膜小窩結(jié)構(gòu)，抑制VEGF/VEGFR2 上下游血管新生相關(guān)通路的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；許揚(yáng)等[19]研究表明蛇莓水煎劑能夠減小雞胚絨毛尿囊膜血管新生面積，破壞組織大中血管結(jié)構(gòu)。因此，筆者猜測蛇莓-白英藥對可能通過調(diào)控VEGF 水平抑制新生血管增生從而治療銀屑病。見圖7。

圖7 VEGF 信號(hào)通路

IL-17 是Th17 細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，其亞型IL-17A 與IL-17F 與銀屑病相關(guān)。研究表明，進(jìn)行期銀屑病患者血清IL-17 水平明顯高于對照組[20]，其作用機(jī)制可能與激活有絲分裂原活化蛋白（MAP）激酶、核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，在干擾素-γ（IFN-γ）的協(xié)同下刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-6、GM-CSF 等炎性因子相關(guān)[21]。其抑制劑secukinumab、ixekizumab、brodalumab 已獲批用于中、重度銀屑病的治療[22]。IL-17 信號(hào)通路顯示IL-17 可以通過激活NF-κB，促進(jìn)IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的釋放從而起到調(diào)節(jié)免疫及誘發(fā)炎性反應(yīng)的作用。見圖8。

圖8 IL-17 信號(hào)通路

在正常的表皮組織中，EGFR 主要存在于基底細(xì)胞層，而在銀屑病患者皮膚基底層和棘層也呈現(xiàn)廣泛表達(dá)，其作用機(jī)制可能與通過酪氨酸激酶（TK）通路與表皮生長因子（EGF）及其家族成員相結(jié)合，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）的過度增殖分化相關(guān)。EGFR-TKIs 是以EGFR 作為靶點(diǎn)，通過與三磷酸腺苷（ATP）競爭性結(jié)合胞內(nèi)的TK 結(jié)構(gòu)域配體結(jié)合位點(diǎn)，抑制EGFR 分子內(nèi)酪氨酸的自身磷酸化和TK活化，阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移等作用[23]。PI3K/Akt 通路在EGFR-TKIs 抵抗過程中發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者PI3K 基因表達(dá)水平、皮損內(nèi)P-Akt 蛋白水平及Akt激酶活性明顯高于正常皮膚，可引起膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖和真皮乳頭血管增生[24]。郭晶等[25]研究證實(shí)很多清熱解毒類中藥均可能有TK 抑制活性。蛇莓、白英有明顯的清熱解毒功效，本研究初步表明其治療銀屑病的機(jī)制可能與抑制TK 活化有關(guān)。但目前尚未有研究明確表明蛇莓、白英可抑制TK 活性，本研究可為未來相關(guān)研究提供理論參考。見圖9。

圖9 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗信號(hào)通路

此外，KEGG 通路富集分析還發(fā)現(xiàn)利什曼病、結(jié)直腸癌、卡波西肉瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、百日咳等疾病可能與銀屑病的發(fā)生有關(guān)，這與既往研究表明銀屑病將增加其患病風(fēng)險(xiǎn)相符，可供進(jìn)一步深入研究[26]。

綜上所述，蛇莓-白英對銀屑病治療有多靶點(diǎn)、多途徑、多通路的特點(diǎn)。其生物學(xué)機(jī)制可能與有機(jī)酸結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物過程及VEGF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、EGFR-TKIs 相關(guān)通路等相關(guān)，為后續(xù)深入驗(yàn)證“蛇莓-白英”治療銀屑病的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。