方世通，祝 宏，金學(xué)平，丁 嬌，馬 峻，王艷武，劉 慧*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心（武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院），湖北 武漢 430205；3.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的，近年帶有多重耐藥性的結(jié)核桿菌（multidrug resistance-mycobacterium tuberculosis，MDR-MTB）日益增加［1］，其驚人增長(zhǎng)加劇了其全球流行。MDR-MTB的高發(fā)病率可能極大地阻礙當(dāng)前的結(jié)核病治療，導(dǎo)致更高的失敗率、更長(zhǎng)的治療時(shí)間和更復(fù)雜的藥物方案。目前，結(jié)核病的化療包括幾種治療方案，MDR-MTB的治療可延長(zhǎng)至2年［2］。一般結(jié)核病治療通常使用的抗生素有利福平、異煙肼［3］、吡嗪酰胺、乙酰水楊酸［4］和乙胺丁醇［5］。但隨著抗生素的濫用，以及耐藥性的日益增強(qiáng)，為了對(duì)抗耐藥性，除了其他藥物取代，還可以將不同藥物雜合在一起，比如將異煙肼和乙酰水楊酸通過一些簡(jiǎn)單的烷烴鏈等共價(jià)鍵連接起來(lái)，得到乙酰水楊酸-異煙肼雜合藥物［6］，期望改善單一作用靶點(diǎn)的異煙肼和乙酰水楊酸藥物分子的耐藥性［7］。

并且，為了方便臨床用藥，提高藥物制劑的靶向性，選擇用包合的方式，將所得藥物分子利用糖類材料包合保護(hù)起來(lái)，其中，糖類材料選擇了β-環(huán)糊精和殼聚糖。

β-環(huán)糊精是由7個(gè)吡喃葡萄糖分子組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀低聚糖，這些亞基通過1，4糖苷鍵連接。環(huán)糊精具有環(huán)形形狀，環(huán)形的較大和較小的開口分別暴露于溶劑仲羥基和伯羥基。由于這種排列，環(huán)的內(nèi)部不是疏水性的，但比水性環(huán)境親水性要低得多，因此能夠容納其他疏水性分子。相反，外部足夠親水以賦予環(huán)糊精（或其復(fù)合物）水溶性。它們不溶于典型的有機(jī)溶劑。具有疏水性分子的環(huán)糊精包合物能夠穿透人體組織，這些可用于在特定條件下釋放生物活性化合物，有著廣泛的應(yīng)用［8-10］。

殼聚糖（chitosan）是直鏈多糖隨機(jī)分布的β-（1→4）-linked-D-glucosamine（脫乙酰單元）和Nacetyl-D-glucosamine（乙?；瘑卧?。殼聚糖可用于幫助通過皮膚輸送藥物，殼聚糖能增強(qiáng)極性藥物跨上皮表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，且具生物相容性和可生物降解性［11］，以及可能存在的疊加抗菌作用［12］。

本文通過使用β-環(huán)糊精、殼聚糖來(lái)包合抗結(jié)核雜合藥物乙酰水楊酸-異煙肼（acetylsalicylic acid-isoniazid，ASA-INH），結(jié)構(gòu)式如圖1所示，得到對(duì)應(yīng)的ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物，通過實(shí)驗(yàn)得出包合的最優(yōu)工藝，并且對(duì)該包合物進(jìn)行了表征實(shí)驗(yàn)，以及檢測(cè)包合物對(duì)結(jié)核桿菌的抗菌活性。

圖1 ASA-INH結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of ASA-INH

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)過程中所用到的主要原料、試劑有：ASA-INH（實(shí)驗(yàn)室自制）、乙酰水楊酸（麥克林試劑，acetylsalicylic acid，ASA）、異煙肼（天津市博迪化工有限公司，isoniazid，INH）、殼聚糖（麥克林試劑）、無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、β-環(huán)糊精（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司）、DMSO（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、Tween-80（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氯化鈉（福晨化學(xué)試劑有限公司）、樹脂天青（麥克林試劑）、7H9培養(yǎng)基（武漢市金銀潭醫(yī)院）。

實(shí)驗(yàn)過程中所用到的主要儀器有：數(shù)顯磁力控溫?cái)嚢杵鳎柫x予華儀器有限公司）；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)尼高力儀器公司）；SII DSC 6220差示掃描量熱儀（日本精工株式會(huì)社）；WFZ-26A紫外可見分光光度計(jì)（武漢圣利興科技有限公司）。

1.2 乙酰水楊酸-異煙肼包合物的制備

1.2.1 飽和水溶液法制備乙酰水楊酸-異煙肼-β-環(huán)糊精包合物 稱取0.3 g ASA-INH，加入5 mL無(wú)水乙醇，使其溶解，滴入β-環(huán)糊精飽和溶液中，該飽和溶液用1.0 gβ-環(huán)糊精制備，攪拌30 min后，在0～4℃中冷藏24 h，抽濾，用少量無(wú)水乙醇去洗滌未被包合的ASA-INH，剩余物經(jīng)過真空干燥，即得ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物。

1.2.2 冷凍干燥法制備乙酰水楊酸-異煙肼-殼聚糖包合物 稱取1.0 g的ASA-INH，用0.1 mol/L的冰醋酸溶液將其溶解，再稱取1.0 g的殼聚糖，同樣將其用0.1 mol/L的冰醋酸溶液溶解，將乙酰水楊酸-異煙肼的冰醋酸溶液緩慢滴入殼聚糖的冰醋酸溶液，攪拌30 min后，在0～4℃中冷藏過夜，隨后進(jìn)行冷凍干燥，用少量的無(wú)水乙醇，將冷凍干燥后的樣品中未被包合的ASA-INH洗去，抽濾，濾餅經(jīng)真空干燥即得ASA-INH-殼聚糖包合物。

1.2.3 包合物中乙酰水楊酸-異煙肼的含量測(cè)定

包合物的包合率、收率分別根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

因此，還需要得到包合物中ASA-INH的含量，該含量可利用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

先配制并量取適量質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL ASA-INH的乙醇溶液，在200～500 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，最終結(jié)果如圖2所示，顯示ASA-INH最大吸收出現(xiàn)在236 nm。

圖2 ASA-INH紫外光譜掃描圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of ASA-INH

以無(wú)水乙醇為空白，并用無(wú)水乙醇配置0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL梯 度 質(zhì) 量 濃 度 的ASA-INH的標(biāo)準(zhǔn)溶液。于236 nm處測(cè)定其紫外吸光度值（A）。

以質(zhì)量濃度（ρ）對(duì)吸光度值（A）進(jìn)行回歸，如圖3所示作圖，得到回歸方程：A=11.87ρ+0.003 7（R2=0.999 3）。

圖3 ASA-INH紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Ultraviolet standard curve of ASA-INH

同樣以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，將ASA-INH的包合物用無(wú)水乙醇配成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的待測(cè)樣品，于236 nm處測(cè)定其紫外吸光度值，將吸光度值代入ASAINH紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程中，計(jì)算得到包合物中ASA-INH的含量。

1.2.4 均勻?qū)嶒?yàn)優(yōu)化工藝 對(duì)同一種材料，同一種制備方式，影響包合常數(shù)的因素主要有3種：客分子和主分子的投料比、包合時(shí)間、包合溫度。

飽和水溶液法制備ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物，為得到較好的包合率和收率，選擇利用均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行條件篩選，通過對(duì)各物質(zhì)穩(wěn)定性等性質(zhì)的考察，最終設(shè)置客分子和主分子的投料摩爾比范圍在0.5～1.5之間（間隔為0.25），包合時(shí)間在0.5～2.5 h之間（間隔設(shè)為0.5 h），溫度范圍在30～70℃之間（間隔設(shè)為10℃）。因素水平表見表1，均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)表見表2。

表1 因素水平Tab.1 Level of factors

表2 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)表Tab.2 Uniform experimental design on U 5（53）

冷凍干燥法制備ASA-INH-殼聚糖包合物，設(shè)置客分子和主分子的投料質(zhì)量比范圍在1～240之間，包合時(shí)間在0.5～2.5 h之間（間隔設(shè)為0.5 h），溫度范圍30～70℃之間（間隔設(shè)為10℃）。因素水平表見表3，均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排表同表2。

表3 因素水平Tab.3 Level of factors

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酰水楊酸-異煙肼包合物制備工藝條件的優(yōu)化

以綜合評(píng)價(jià)（綜合評(píng)價(jià)=包合率×0.7+收率×0.3）為指標(biāo)，表4為飽和水溶液法均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果采用“IBM SPSSStatistics”軟件，通過綜合評(píng)價(jià)（E1）、客分子和主分子的投料摩爾比（X1）、包合時(shí)間（Y1）、包合溫度（Z1），對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為E1=66.343+0.397Z1-0.123X1Z1+0.06Z1Y1。

表4 飽和水溶液法均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果Tab.4 Results of uniform experimental design for saturated aqueous solution method

利用Excel軟件的編程解，分析處理該回歸方程得最優(yōu)工藝條件：ASA-INH與β-環(huán)糊精摩爾比為0.5∶1，包合溫度為70℃，包合時(shí)間為2.5 h，綜合評(píng)價(jià)（E1）經(jīng)回歸方程計(jì)算得90.9%。

同樣以綜合評(píng)價(jià)為指標(biāo)，表5為冷凍干燥法均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果。

表5 冷凍干燥法均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果Tab.5 Results of uniform experimental design for freeze-drying method

采取同樣的數(shù)據(jù)分析處理方法，得回歸方程為E2=67.902-0.036X2+0.02Z22+0.023Z2Y2，以 及 最優(yōu)工藝條件：ASA-INH與殼聚糖質(zhì)量比為1∶1，包合溫度為70℃，包合時(shí)間為2 h，綜合評(píng)價(jià)（E2）經(jīng)回歸方程計(jì)算得81.6%。

2.2 包合物的表征結(jié)果

2.2.1 紅外光譜法 比較圖4中的b與c、e與f可知，2種包合物的紅外譜圖雙鍵區(qū)和指紋區(qū)的吸收峰明顯少于2種物理混合物，并且于1 675 cm-1的C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰在兩種包合物的紅外譜圖中消失，這是因?yàn)榘l(fā)生了掩蔽作用，該作用產(chǎn)生的原因可能是ASA-INH分子進(jìn)入β-環(huán)糊精空腔內(nèi)，并且殼聚糖和ASA-INH存在分子間作用力，這證明有ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物生成［13］。

圖4 紅外光譜掃描圖：（a）β-環(huán)糊精，（b）ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物，（c）ASA-INH與β-環(huán)糊精的物理混合物，（d）殼聚糖，（e）ASA-INH-殼聚糖包合物，（f）ASA-INH與殼聚糖物理混合物Fig.4 Infrared spectrum scan：（a）β-cyclodextrin，（b）ASA-INH-β-cyclodextrin inclusion compound，（c）physical mixture of ASA-INH andβ-cyclodextrin，（d）chitosan，（e）ASA-INH-chitosan inclusion compound，（f）physical mixture of ASA-INH and chitosan

2.2.2 差示掃描量熱法 用空白鋁箔盒為對(duì)照，在0～300℃的溫度范圍內(nèi)，掃描速度為20℃/min，得到了ASA-INH、β-環(huán)糊精、ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH和β-環(huán)糊精物理混合物的吸熱峰（圖5），以及ASA-INH、殼聚糖、ASA-INH-殼聚糖包合物、ASA-INH和殼聚糖物理混合物的吸熱峰（圖6）。

圖5 樣品DSC熱譜圖Fig.5 DSCthermograms of samples

圖6 樣品DSC熱譜圖Fig.6 DSC thermograms of samples

由圖5和圖6可知，ASA-INH在183℃有一吸熱峰，應(yīng)該是其熔點(diǎn)，而2種包合物DSC曲線中并無(wú)該峰，并且β-環(huán)糊精、ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物均在118℃處出現(xiàn)吸熱峰，殼聚糖、ASA-INH-殼聚糖包合物均在115℃左右處出現(xiàn)吸熱峰，證明ASA-INH和β-環(huán)糊精、ASA-INH和殼聚糖均已形成包合物［14］，再看到2種物理混合物的DSC曲線中，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)吸熱峰，包括原料雜合物的熔點(diǎn)峰，表明該混合物只是簡(jiǎn)單的混合，并無(wú)新物質(zhì)生成。

2.3 包合物抗菌活性測(cè)試

2.3.1 主要試劑配制 分別稱ASA、INH、ASAINH、ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物各50 mg，分別用去離子水定容于50 mL的容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，其中，實(shí)驗(yàn)最大質(zhì)量濃度設(shè)為0.5 mg/mL，并以此往下做對(duì)倍稀釋。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 微孔顯色法，采用盲法編排測(cè)試程序。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株為標(biāo)本，通過氧化還原指示劑顯色法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的耐藥性，藥物的敏感性可由指示劑的顏色變化得到［15］。以不加藥物的培養(yǎng)基為對(duì)照組，紅色表示耐藥（R），藍(lán)色表示敏感（S）。培養(yǎng)基的顯色情況可以反映出不同藥物對(duì)H37RV生長(zhǎng)的影響，藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）是培養(yǎng)基顯藍(lán)色最低濃度［16］。

根據(jù)表6的初步活性數(shù)據(jù)顯示，相對(duì)于原料ASA和INH而言，ASA-INH的抗菌最低濃度更低，表明其抗菌活性增強(qiáng)。

表6 藥物抗菌活性Tab.6 Antibacterial activities of drugs

本實(shí)驗(yàn)選擇的雜合物和制備的2種包合物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV的MIC值相同，并且發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精包合的藥物比殼聚糖包合的藥物具有更強(qiáng)的抗耐藥性和殺菌活性，推測(cè)可能是由于載體的親水性，因此可以限制MarR介導(dǎo)的雜合物外排，從而消除MarR影響，以減少耐藥性對(duì)其的影響，對(duì)于使用殼聚糖包合的，還可能存在一部分的疊加抗菌效應(yīng)［12］。

3 結(jié) 論

本文基于β-環(huán)糊精和殼聚糖為包合物載體，采用飽和水溶液法制備ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物，冷凍干燥法制備ASA-INH-殼聚糖包合物。通過均勻設(shè)計(jì)，結(jié)果表明，ASA-INH與β-環(huán)糊精的最佳包合工藝條件為：ASA-INH與β-環(huán)糊精摩爾比為0.5∶1、包合溫度70℃、包合時(shí)間2.5 h，綜合評(píng)價(jià)為90.9%。ASA-INH與殼聚糖的最佳包合工藝條件為：ASA-INH與殼聚糖物質(zhì)的量比1∶1、包合溫度70℃、包合時(shí)間2 h，綜合評(píng)價(jià)為81.6%。經(jīng)抗菌活性測(cè)試，ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物的活性比乙酰水楊酸、異煙肼及乙酰水楊酸-異煙肼都有著更低的MIC，并且發(fā)現(xiàn)ASA-INH-β-環(huán)糊精有著最低的MIC（≤0.052μmol/mL），值得進(jìn)一步開發(fā)。