段培培， 葉振沖， 范 文， 李天強， 于聰聰， 相如蘭

(南陽理工學院 河南 南陽 473004)

0 引言

種植窗期，良好的子宮內膜狀態(tài)是胚胎能否順利植入母體的關鍵環(huán)節(jié)。處于激活狀態(tài)的囊胚，通過黏附、侵襲、植入子宮蛻膜，開啟母胎循環(huán)。同時要求母體子宮內膜同步建立良好的接受態(tài)，此狀態(tài)持續(xù)1～2天，是胚胎著床和早孕絨毛侵襲母體的黃金時期。當前影響子宮內膜容受狀態(tài)的因素主要涉及解剖器官異常、排卵障礙型疾病、手術器械所致的內膜損傷、宮腔粘連、宮腔內器質性病變等諸多方面，發(fā)病機制多樣且復雜，治療難度大，以手術、藥物對癥治療為主，療效因人而異。因此，明確發(fā)病機制且尋求有效的中西醫(yī)結合方法是治療本病的關鍵。中醫(yī)學安胎由來已久，基于“腎系胎、血載胎”的生殖理論，認為精虧血少是胚胎著床失敗的常見病機，當補腎填精、養(yǎng)血載胎。傅氏“調經種子”經世名方養(yǎng)精種玉湯，由熟地黃、白芍、當歸、山茱萸組成，特于補血，純于填精，主治腎虧血虛，久不受孕。但中藥復方成分復雜，作用靶點尚未闡明。因此，本研究擬運用網絡藥理學方法，由藥物活性成分、潛在靶點為切入點，探究養(yǎng)精種玉湯改善子宮內膜容受性的多重分子機制。

1 材料與方法

1.1 有效成分及其靶點基因的檢索

以 “熟地黃、山茱萸、當歸、白芍”為關鍵詞，導入TCMSP數(shù)據(jù)庫，設置OB≥30% ，DL≥0.18，進行養(yǎng)精種玉湯有效活性成分的篩選，并檢索出相關靶點；隨后將靶點導入Uniport數(shù)據(jù)庫，搜索物種為“Homo sapiens”，進行基因名稱校正。

1.2 疾病靶點的篩選

以 “Endometrial receptivity during implantation window”為關鍵詞，導入 Genecards數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫，檢索相關的靶點基因并保存。

1.3 “養(yǎng)精種玉湯-種植窗期子宮內膜容受性”的蛋白間相互作用可視圖的構析

Venny R軟件比對分析藥物和疾病靶點，繪制韋恩圖“藥物-疾病”交互靶點。Cytoscape 3.7.2軟件構建一體“藥物-疾病”蛋白網絡互作圖，進行可視化分析。

1.4 “化合物-有效成分-作用靶點-疾病靶點”的可視化分析

將以上的“有效成分及其靶點基因、疾病靶點基因、藥物-疾病的交集蛋白靶點” 導入Cytoscape，進行可視化網絡分析。

1.5 基于David進行GO及KEGG富集分析

將1.3節(jié)中交互靶點導入David數(shù)據(jù)庫進行基因本體(GO)富集分析，分別描述靶點的生物學過程(GO-BP)、細胞組分(GO-CC)、分子功能(GO-MF)；同時進行基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，獲得相關生物學過程和各條關鍵的信號通路。

2 結果

2.1 養(yǎng)精種玉湯有效活性成分的篩選

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出養(yǎng)精種玉湯所含化合物：熟地黃76 種、當歸 125 種、山茱萸 226種、白芍85種；在OB≥ 30% 、DL ≥ 0.18 的條件下，獲得37種有效化學成分，其中熟地黃 2 種(谷甾醇、豆甾醇)、當歸 1種(β-谷甾醇)、山茱萸 20種(山茱萸環(huán)烯醚萜及苷、多糖類等)、白芍13種(芍藥苷、芍藥內酯苷等)，將重復性的藥效成分刪除不計入，共計31種藥效成分被查找到(部分主要成分見表1)。

表1 養(yǎng)精種玉湯的31種有效活性成分

2.2 疾病靶點的篩選

設置關鍵詞為“Endometrial receptivity during implantation window”，檢索結果數(shù)量分別為378、377。去除搜集到的重復靶點后，導入Uniport 數(shù)據(jù)庫，對靶點基因進行簡稱化。相關性分數(shù)提示靶點與子宮內膜容受性的關聯(lián)緊密度，二者呈正相關。依據(jù)相關性分數(shù)排序，排名前10位的靶點信息見表2。

表2 種植窗期子宮內膜容受性的部分靶點及靶點描述

2.3 “藥物-疾病”交集作用靶點的預測分析

將2.1節(jié)中31種有效成分所對應的114個作用靶點和4209個子基因，與2.2節(jié)中的378個疾病靶點，導入Venny R 分析軟件，繪制交集靶點韋恩圖(見圖1)，圖中獲取249個“藥物-疾病”交集靶點基因，其中黏附分子(CD44)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、整合素α5(ITGα5)、氧化氮合酶(NOS2)、間質-上皮細胞轉化因子(MET)等參與細胞生長、黏附、侵襲過程。內皮素1(EDN1)、血管內皮生長因子(VEGF)等參與血管平滑肌收縮、血管生成，調控組織血流灌注。CXC族趨化因子受體(CXCR4)、瘦素(LEP)、叉頭轉錄因子(FOXP3)等激活細胞免疫、炎癥活動，調節(jié)免疫-炎癥微環(huán)境。分析計算得出靶點基因映射率為5.9%，提示該方對于改善子宮內膜容受狀態(tài)特異性顯著。

圖1 養(yǎng)精種玉湯與種植窗期子宮內膜容受性的 249 個交集靶點韋恩圖

2.4 養(yǎng)精種玉湯與種植窗期子宮內膜容受性交集靶點的 PPI 網絡分析

將2.3節(jié)中所獲得的249個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，設置搜索物種為 “人”，medium confidence篩選值設為大于0.900(有統(tǒng)計學意義)，得到“藥物成分-疾病關聯(lián)蛋白”的互作信息圖。后將獲取的蛋白互作信息以tsv形式導入 Cytoscape軟件中分析，篩選度值最大且相同的兩個節(jié)點—STAT3、APP及其有互作關聯(lián)的其他靶點。依據(jù)度值越大，該基因或通路對疾病的影響越大，篩選出排前30位的節(jié)點(見圖2)。其中KNG1(激肽原-1)在不同條件下，可激活AKT(蛋白激酶)、EGF(表皮生長因子)、EGFR(表皮生長因子受體)、FN1(纖維連接蛋白)、MAPK(絲裂原激活的蛋白激酶)、STAT3(信號轉導與轉錄激活因子3)等信號通路，參與細胞生長、增殖、侵襲等生理活動。TNF(腫瘤壞死因子)協(xié)同IL6(白介素6)、IL10(白介素10)等激活免疫-炎癥反應，調控種植窗期子宮內膜微環(huán)境。VEGFA(血管內皮生長因子A)協(xié)同STAT3、EGFR等調節(jié)血管生成，改善子宮內膜血流灌注。上述靶點可能是通過不同角度改善子宮內膜容受性促進種植窗期胚胎順利著床的關鍵靶點。

圖2 養(yǎng)精種玉湯改善種植窗期子宮內膜容受性度值排名前30位的較大節(jié)點注：橫坐標代表靶點的度值；縱坐標為排名先后的各節(jié)點

2.5 GO 富集分析

將疾病核心靶點基因導入Enrichr數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，得到具有統(tǒng)計學意義的88條富集結果(P<0.01)，其中排名前20的主要涉及癌癥相關通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K-Akt)、缺氧誘導因子(HIF-1)、叉頭轉錄因子(FoxO)、Toll樣受體4(TLR4)等信號通路。David 6.8 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行功能注釋分析，結果顯示BP、CC、MF數(shù)量，分別為644、55、88(P<0.01)。其中BP主要包括白介素的正向調節(jié)、各類蛋白激酶活性激活，樹突細胞-細胞因子的免疫應答，細胞增殖、凋亡、侵襲的信號轉導，性激素水平(雌、孕激素的分泌及代謝過程)等。CC主要集中于細胞免疫突觸、內吞囊腔、細胞外囊泡、血液微粒、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子、Wnt 信號復合體等，MF主要體現(xiàn)在蛋白質粒子結合、HMG結構域結合、參與Wnt 信號通路的受體激活、支架蛋白結合、細胞間鈣黏蛋白結合、細胞基質膠原區(qū)域結合等方面。

2.6 KEGG 信號通路富集分析

將2.3節(jié)中所獲得的249個“藥物-疾病”交集靶點基因導入David 6.8數(shù)據(jù)庫，方法同1.5節(jié)進行KEGG富集分析，得到具有統(tǒng)計學意義的101條信號通路(P<0.01)。選擇排名前20的信號通路進行可視化分析(見圖3)。圖中氣泡的直徑與該富集通路中蘊含的基因個數(shù)呈正相關；氣泡灰度表示偽發(fā)現(xiàn)率，其深淺與該富集通路的偽發(fā)現(xiàn)率呈負相關。

圖3 養(yǎng)精種玉湯改善種植窗期子宮內膜容受性的KEGG信號通路氣泡圖注：氣泡的直徑大小表示通路中的靶點基因數(shù)量；顏色深淺代表偽發(fā)現(xiàn)率(FDR值)

3 討論

妊娠早期，胚胎能否順利植入母體子宮歷經著一系列有序且復雜的生理學過程，其要求激活狀態(tài)的胚胎與母體內膜的容受狀態(tài)保持同步。因此，種植窗期子宮內膜接受態(tài)的建立和良好母胎界面微環(huán)境的形成是其關鍵環(huán)節(jié)，亦是胎兒得以生長、發(fā)育的組織學基礎。當前臨床醫(yī)學診療子宮內膜源性疾病的方法以彩超、宮腔鏡等檢測其形態(tài)學變化、血流灌注等，蛋白組學、代謝組學和單細胞測序分析其分子機制靶點[1-3]，但其成本昂貴、個體差異顯著，治療仍以手術、藥物對癥治療為主。而中醫(yī)安胎歷經千年，流傳至今，有著自身獨特優(yōu)勢和治療理念。傅山(清)[4]提出：“精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物，皆有子之道也”，認為胎元初結于母體胞宮，需精滿氣盛，血脈暢達，此得以載胎至足月。本方由補血調經第一名方——四物湯加減化裁而成，方中去川芎而特加山萸肉以滋補肝腎，補益精血，使養(yǎng)精種玉湯全方藥物配合不特于補血，而純于填精。方中重用填精之要藥九蒸九制熟地黃，配伍蒸熟山茱萸，其妙在于補中帶收，正應“腎主封藏”之象；當歸補益精血，補而不膩；白芍養(yǎng)血柔肝，養(yǎng)中有行，行中有斂。全方配伍嚴謹，詮釋了“精滿血足，方可種子”的經典生殖理論。

當前中醫(yī)藥的傳承發(fā)展以臨床積累、師承研究為主，中藥復方雖療效顯著，但因其成分復雜、靶點繁多，具體的作用機制尚未明了。而網絡藥理學作為高效的生物信息學分析方法，為進一步研究中藥成分的分子機制提供方向。臨床中子宮內膜容受性低下主要涉及子宮因素的內膜過薄、內膜息肉、子宮內膜炎性改變、宮腔粘連和卵巢分泌功能紊亂[5]等方面，發(fā)病機制與卵巢性激素分泌、種植窗期母胎界面母體子宮內膜局部分子[6]及胎源性分泌的因子異常有關。研究結果顯示，養(yǎng)精種玉湯所含口服利用率較高的β-谷甾醇、豆甾醇、芍藥苷、山茱萸多糖、山茱萸環(huán)烯醚萜及苷、芍藥內酯苷等可能是改善種植窗期子宮內膜容受性的主要生物活性成分。后通過成分-疾病靶點網絡分析可知，STAT3、APP、IL6、KNG1、MAPK3、MAPK1、VEGFA、FN1、AKT1、EGF等核心靶點在改善種植窗期子宮內膜容受性時發(fā)揮主要作用，主要體現(xiàn)在調控子宮內膜適度增殖、凋亡，促進內膜生長、血管生成及改善母胎界面免疫-炎癥微環(huán)境方面。雖該方治療婦科領域疾病的機制研究甚少，但已有學者證實方中有效活性成分通過調控上述靶點，廣泛應用于其他疾病的臨床治療中。石和元[7]等證實山茱萸多糖可以通過調節(jié)IL-2、IL-10的蛋白表達，CD4+、CD8+T細胞水平，平衡Th1/Th2比值，提高小鼠的免疫功能。周強[8]等證實β-谷甾醇可以通過下調TNF-α、FN、Cas-3水平，上調IL-1β、IL-4表達，抑制肺組織凋亡，改善局部免疫-炎癥微環(huán)境，延緩急性肺損傷所致的纖維化進程。王貞麗[9]等發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過改善血管內皮舒縮因子、減輕氧化應激損傷，糾正低氧性肺動脈高壓的血管重塑。徐大偉[10]等在體外細胞實驗中證實芍藥苷可通過負反饋STAT3信號通路，激活垂體瘤細胞凋亡因子，抑制其生長。

本研究中GO及KEGG富集分析提示：該方主要通過調控種植窗期母胎界面細胞增殖和炎癥、免疫反應等生物學過程，并在以細胞免疫突觸、內吞囊腔、細胞外囊泡及細胞表面為主的細胞組分處發(fā)揮良性作用；影響蛋白質粒子結合、性激素水平、支架蛋白結合域、細胞間鈣黏蛋白結合、細胞基質膠原結合域及生長因子活性等分子功能；同時以癌癥、PI3K-AKT、FoxO、VEGF等信號通路為主參與改善種植窗期子宮內膜容受性以促進胚胎著床的過程，且不同信號通路間存在交叉激活。其中FoxO家族中FOXA2是影響內膜容受性的啟動因子，受雌激素的負反饋調控，同時可被Wnt通路、黃體酮激活?；罨腇OXA2可通過激活細胞間鈣黏蛋白(E-CDH1)，上調白血病抑制因子(LIF)，最終激活JAK/STAT3信號通路[11]，促進種植窗期子宮內膜蛻膜化，調節(jié)免疫-炎癥應答，促進胚胎順利著床。此外，當下因手術器械所致的子宮內膜損傷是影響其容受性的常見因素，薄型子宮內膜、血供不足是其主要表現(xiàn)。李新安[12]等發(fā)現(xiàn)在子宮內膜膠原結合域(CBD)，CBD-VEGF可特異性與膠原結合，促進內膜螺旋小動脈的生成，改善局部血流灌注，修復受損的子宮內膜及平滑肌。張良[13]等證實養(yǎng)精種玉湯可通過上調反復試管著床失敗患者子宮內膜分泌物中VEGF、IL-1β的表達，下調單核細胞趨化蛋白-1的表達，改善種植窗期子宮內膜形態(tài)和血流灌注，優(yōu)化子宮內膜容受狀態(tài)，提高妊娠率。

綜上，養(yǎng)精種玉湯可能通過改善內膜生長、分泌狀態(tài)和局部血流灌注、平衡母胎界面免疫-炎癥微環(huán)境，修復內膜損傷等多途徑促進胚胎著床。其多成分、多靶點、多通路的作用特點，為深入研究其助孕機制提供方向，為婦科其他炎性疾病、腫瘤疾病的治療提供診療思路和潛在空間。但由于中藥復方成分、靶點復雜，后期仍需要大量的動物實驗及臨床研究的證實。