苑致維 ，張爾馨 ，鄭沁薇 ，楊丹 ，吳悠 ，郝微微

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2.上海市中醫(yī)藥研究院脾胃病研究所，上海 200032

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及結(jié)直腸黏膜及黏膜下層，主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。目前有關(guān)UC的病因、發(fā)病機(jī)制尚不明確。一般認(rèn)為腸道免疫功能紊亂是主要原因。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來 UC在亞洲國家患病率大幅增加。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一種多效性細(xì)胞因子，具有明顯的抗炎活性，活化的TGF-β與其受體結(jié)合，通過TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，是治療UC的關(guān)鍵靶標(biāo)。上海市名中醫(yī)馬貴同教授認(rèn)為，濕、熱、瘀互結(jié)腸道為UC發(fā)病的關(guān)鍵，治以清熱化濕、活血止血，并以青黛、三七等中藥制成直腸給藥制劑清腸栓。既往對(duì)清腸栓進(jìn)行多次拆方研究發(fā)現(xiàn)，方中青黛對(duì)UC治療起主要作用。課題組前期研究表明，青黛及其主要成分靛玉紅能不同程度修復(fù) UC小鼠結(jié)腸損傷，促進(jìn)黏膜愈合。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，基于TGF-β/Smad信號(hào)通路進(jìn)一步探討青黛治療UC的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0012。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度 40%～70%，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，通風(fēng)環(huán)境。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（YYLAC-2020-080）。

1.2 藥物及制備

青黛配方顆粒，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，批號(hào)19052101。將3 g青黛配方顆粒溶于20 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，配制成濃度為0.15 g/mL青黛混懸液。美沙拉嗪栓，黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)191203，取1 g美沙拉嗪栓溶于20 mL 0.5%CMC-Na溶液，配制成濃度為0.05 g/mL美沙拉嗪液。

1.3 主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Bio公司，貨號(hào)SR01636；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒，上海昕達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)BL521A；組織裂解液、蛋白酶抑制劑、HE染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P0013B、ZS018、C0105；化學(xué)發(fā)光試劑盒，美國 Thermo公司，批號(hào) RJ238638；SDS-PAGE配膠試劑盒，上海雅酶生物科技有限公司，貨號(hào) PG111-7.5；TGF-β、Smad2/3、p-Smad2/3抗體，美國CST公司，貨號(hào)分別為3711、8685、8828；糞便隱血試劑組，珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)BA-2020E；通用型RNA提取試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-Green試劑盒，上海艾科瑞生物科技有限公司，批號(hào)分別為 AG21017、AG11706、AG11701。Synergy H4型多功能酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司），TG16W微型離心機(jī)（北京天根生化科技有限公司），5417R型離心機(jī)（德國 Eppendorf公司），X85-2S恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司），HERA safe KS12型超凈工作臺(tái)（美國Thermo Fisher公司），IX71/BX53型顯微鏡（日本Olympus公司），垂直電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio Rad公司），TP1020自動(dòng)脫水機(jī)（德國Leica公司），TEC-2601攤片機(jī)（上海精密儀器儀表有限公司），MX-S渦旋混勻儀（美國 Scilogex公司），EG1150H＋C石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司），RM2235切片機(jī)（德國Leica公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為正常組、模型組、青黛組、美沙拉嗪組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，模型組、青黛組、美沙拉嗪組大鼠自由飲用5%DSS溶液7 d，制備UC大鼠模型，正常組飲用蒸餾水。

2.2 給藥

造模結(jié)束后，青黛組和美沙拉嗪組分別予青黛混懸液（0.27 g/kg）、美沙拉嗪液（0.1 g/kg）灌腸（給藥劑量按70 kg成人臨床常用劑量與大鼠體表面積換算），給藥體積 0.4 mL，正常組和模型組予等體積CMC-Na溶液灌腸，連續(xù)7 d。將大鼠置于固定器內(nèi)，暴露肛門位置，一手固定其尾部，一手將采血軟管輕輕旋轉(zhuǎn)進(jìn)入腸管（約7～8 cm），軟管另一端連接注射器，緩慢推入相應(yīng)藥液，灌腸完畢拔出軟管，用紗布及夾子夾住肛門，提起大鼠尾巴倒懸15 min，將大鼠放回籠內(nèi)，自由活動(dòng)15 min后取下夾子。

2.3 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

每日記錄大鼠體質(zhì)量變化，觀察大鼠糞便性狀改變，按試劑盒說明書檢測(cè)糞便隱血情況，計(jì)算大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)。疾病活動(dòng)指數(shù)＝（體質(zhì)量評(píng)分＋糞便性狀評(píng)分＋隱血評(píng)分）÷3。體質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)量無減輕計(jì)0分，體質(zhì)量減輕≤5%計(jì)1分，5%＜體質(zhì)量減輕≤10%計(jì)2分，10%＜體質(zhì)量減輕≤15%計(jì)3分，體質(zhì)量減輕＞15%計(jì)4分；糞便性狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常計(jì)0分，松散便計(jì)2分，水樣腹瀉計(jì)4分；隱血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常計(jì)0分，隱血計(jì)2分，肉眼血計(jì)4分。

2.4 取材

干預(yù)結(jié)束后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置15 min，4 ℃、3 000/min離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取回盲部至遠(yuǎn)端直腸區(qū)結(jié)腸，縱向剪開，預(yù)冷的生理鹽水沖洗2次，洗凈糞便，吸干水分，記錄結(jié)腸長度。每只大鼠取1 cm結(jié)腸，放入10%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)病理觀察。其余結(jié)腸分裝于凍存管，置于-80 ℃冰箱保存。

2.5 HE染色

大鼠結(jié)腸置于10%多聚甲醛中固定2 d，蒸餾水沖洗5 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.6 Western blot檢測(cè)

取大鼠結(jié)腸，加入裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后，等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入TGF-β（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）和p-Smad2/3（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，采用GelDoc Go凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，Image J圖像分析軟件分析目的蛋白灰度值。

2.7 RT-PCR檢測(cè)

稱取50 mg大鼠結(jié)腸，液氮中研磨成粉末，加適量裂解液，超低溫勻漿器勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，RNA提取試劑盒提取總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行PCR，配制20 μL反應(yīng)體系，按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1，以β-actin為內(nèi)參，采用2法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 青黛對(duì)模型大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的影響

正常組大鼠反應(yīng)靈敏、毛色光滑，體質(zhì)量正常增長，糞便呈麥粒狀；模型組大鼠反應(yīng)遲鈍、毛色黯淡、體形消瘦，糞質(zhì)較軟，出現(xiàn)肉眼血便，其中因便血嚴(yán)重、體質(zhì)量下降明顯死亡2只；青黛組、美沙拉嗪組大鼠上述表現(xiàn)均有不同程度改善，因便血嚴(yán)重、體質(zhì)量下降明顯各死亡1只。

與正常組比較，模型組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，青黛組、美沙拉嗪組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)明顯降低（＜0.05，＜0.01），見表2。青黛組、美沙拉嗪組肉眼血便轉(zhuǎn)為無血便。

表2 各組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)比較（±s）

4.2 青黛對(duì)模型大鼠結(jié)腸長度的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸長度明顯縮短（＜0.01）；與模型組比較，美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸長度明顯增加（＜0.05），青黛組大鼠結(jié)腸長度無明顯變化（＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸長度比較（±s，cm）

4.3 青黛對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，無充血及水腫，腺體結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無潰瘍形成，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮破損，伴充血水腫，腺體排列紊亂，部分壞死或消失，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤，并有潰瘍形成；青黛組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜上皮損傷有所修復(fù)，腺體、杯狀細(xì)胞增多，排列較整齊，炎性細(xì)胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺＝100 μm）

4.4 青黛對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)化生長因子-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織 TGF-β、p-Smad2/3蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，青黛組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05），美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、p-Smad2/3蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、Smad2、Smad3和p-Smad2/3蛋白表達(dá)比較（±s）

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、Smad2、Smad3和p-Smad2/3蛋白免疫印跡

4.5 青黛對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)化生長因子-β、Smad2、Smad3、Snail mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織 TGF-β、Smad3、Snail mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，青黛組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、Smad3、Snail mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.05），美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、Smad2、Smad3、Snail mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、Smad2、Smad3和Snail mRNA 表達(dá)比較（±s）

5 討論

UC屬中醫(yī)學(xué)“痢疾”“腸澼”范疇?！端貑?太陰陽明論篇》指出，“食飲不節(jié)，起居不時(shí)者，陰受之……陰受之則入五臟……入五臟則?滿閉塞，下為飧泄，久為腸澼”。主要因外感濕熱邪毒、情志失調(diào)、飲食不節(jié)等致濕熱瘀滯大腸，氣滯血瘀、脂膜血絡(luò)受損。

青黛味咸，性寒，歸肝、肺、胃經(jīng)，有清熱、涼血、解毒之功?！断赡榧酚涊d久瘧飲治療久瘧：“青黛（澄去灰土）、雄黃（水飛）各等分。為末。每歲一分，空心及夜，淡醋湯下，塊消其病即止。”現(xiàn)代研究表明，青黛具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)黏膜愈合等作用。本研究結(jié)果顯示，正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，無充血及水腫，腺體結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮破損，伴充血及水腫，腺體排列紊亂，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤；青黛組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜上皮損傷有不同程度修復(fù)，腺體增多，排列較為整齊，炎性細(xì)胞明顯減少。表明青黛能有效抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)UC大鼠結(jié)腸損傷，促進(jìn)黏膜愈合。

免疫功能障礙、易感基因及環(huán)境等綜合作用是導(dǎo)致UC發(fā)病的最主要原因，機(jī)體分泌大量炎癥介質(zhì)與炎癥細(xì)胞因子造成腸黏膜受損。UC發(fā)病時(shí)，腸黏膜通透性發(fā)生改變，腸腔內(nèi)有害物質(zhì)進(jìn)入黏膜固有層，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青黛可能通過調(diào)節(jié) CD4CD25Treg細(xì)胞、CD4T細(xì)胞及Foxp3蛋白表達(dá)，發(fā)揮治療UC的作用。TGF-β是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子，包括免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，其作為抑制免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能。TGF-β可抑制腸道炎癥反應(yīng)，有助于誘導(dǎo)免疫耐受，恢復(fù)受損的TGF-β信號(hào)通路被認(rèn)為是治療炎癥性腸病的途徑。在Smad依賴的經(jīng)典途徑中，p-Smad2和p-Smad3可形成二聚體后再與Smad4形成復(fù)合物，復(fù)合物可進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。研究顯示，炎癥性腸病腸內(nèi)炎癥特征由TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)受損、p-Smad2/3表達(dá)降低和Smad7（Smad3磷酸化抑制劑）表達(dá)升高引起。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、p-Smad2/3蛋白表達(dá)降低，青黛干預(yù)后，結(jié)腸組織TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3 蛋白及 TGF-β、Smad3、Snail mRNA表達(dá)上調(diào)，提示青黛可能通過TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)黏膜修復(fù)。

綜上所述，青黛在抑制UC大鼠炎癥反應(yīng)和促進(jìn)損傷修復(fù)兩方面同時(shí)發(fā)揮作用，其作用機(jī)制可能與TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。青黛如何調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路發(fā)揮治療 UC的作用有待今后進(jìn)一步研究。