劉麗君，楊蘭欽

福州仁量生物制品有限公司（福州 350015）

我國水產(chǎn)資源豐富，水產(chǎn)品加工產(chǎn)生大量廢棄物，對其進(jìn)行綜合再利用不僅節(jié)約資源，還能產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)效益。眾多魚類加工廢棄物中都含有豐富的膠原蛋白，其中可食水生動物魚鰾的蛋白質(zhì)含量達(dá)80%，是一種蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、富含多種礦物質(zhì)及微量元素的優(yōu)質(zhì)膠原蛋白來源[1-2]。以魚鰾為原料，經(jīng)過提取、精制生產(chǎn)，可得到相對分子質(zhì)量低于10 000 Da的膠原蛋白肽。膠原蛋白肽具有較好的溶解性和熱穩(wěn)定性，在體內(nèi)可被直接吸收，利用率高，且具有抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等諸多功效，可被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、化妝品等領(lǐng)域[3-5]。近年來，膠原蛋白肽吸收性和生物活性的研究已取得較大進(jìn)展[6-7]。有研究表明相比于蛋白質(zhì)和游離氨基酸，肽類物質(zhì)在腸道內(nèi)不需降解直接被吸收，其轉(zhuǎn)運(yùn)速度快，吸收率更高，且相對分子質(zhì)量越小吸收率越高[8-9]。相比其他來源，魚源膠原蛋白肽的生物活性更優(yōu)，且活性較高的膠原蛋白肽其相對分子質(zhì)量一般在2 000 Da以下[10-11]。

膠原蛋白肽的提取方法有酸法提取、堿法提取、熱水提取、酶法提取[12-13]。其中，酶法提取具有提取率高、條件溫和、對膠原蛋白破壞性小等優(yōu)勢，還可以利用蛋白酶的專一性控制水解程度，制備不同分子量的多肽[14]。應(yīng)用較多的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。其中，木瓜蛋白酶具有對反應(yīng)條件要求低、價格便宜等優(yōu)點(diǎn)，從而得到廣泛應(yīng)用。更有報道稱用木瓜蛋白酶水解魚鰾比其他蛋白酶產(chǎn)生的多肽具有更高的抗氧化能力[15]。

相對分子質(zhì)量是膠原蛋白肽重要的質(zhì)量指標(biāo)[16]。針對魚鰾膠原蛋白肽的研究多以抗氧化性為主，以相對分子質(zhì)量大小為提取目標(biāo)的報道比較少見。故以膠原蛋白肽相對分子質(zhì)量為考察指標(biāo)，綜合考慮其吸收性和生物活性的影響，采用木瓜蛋白酶酶解魚鰾制備相對分子質(zhì)量小于2 000 Da的膠原蛋白肽液，并測定其對DPPH自由基的清除率，配制成膠原蛋白肽飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

魚鰾（干制品，購于福州市永輝超市）；低聚果糖（液體，山東百龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司）。

1.1.2 主要試劑

木瓜蛋白酶（廣州華琪生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；三氟乙酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；膠原蛋白肽檢測標(biāo)樣（上海博升生物科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（AEU-210型，日本島津公司）；電熱恒溫水浴鍋（HH-2型，余姚市科洋儀表廠）；高效液相色譜儀（LC-100型，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；可見分光光度計（7230G型，上海儀電分析儀器有限公司）；離心機(jī)（TDL-80-2B型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；pH計（PHS-25型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 魚鰾膠原蛋白肽液的制備。

干魚鰾加水浸泡過夜，洗凈瀝干水分后剪碎，加入干品質(zhì)量35倍的去離子水，勻漿。在自然pH條件下加入適量木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解。于100 ℃水浴滅酶10 min，以4 000 r/min離心10 min，得到的上清液為魚鰾膠原蛋白肽液。

1.3.2 魚鰾酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、酶解時間、加酶量作為關(guān)鍵因子，應(yīng)用軟件Design-Expert進(jìn)行試驗設(shè)計，以相對分子質(zhì)量低于2 000 Da的膠原蛋白肽所占比例為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)酶解條件。因素水平設(shè)計見表1。

表1 酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平

1.3.3 膠原蛋白肽相對分子質(zhì)量的測定。

參照GB 31645—2018附錄A相對分子質(zhì)量小于10 000 Da的膠原蛋白肽所占比例的檢測方法（高效體積排阻色譜法）[17]。采用的分離柱為TSK Gel G2000 SWXL，流動相為乙腈、水、三氟乙酸，體積比40∶60∶0.05，流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm。標(biāo)準(zhǔn)品采用細(xì)胞色素C（MW12384）、抑肽酶（MW6512）、桿菌酶（MW1423）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）。相對分子質(zhì)量的對數(shù)（lgMW）與保留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.171 59X+6.837 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.977 0，式中Y表示保留時間，單位為min，X表示相對分子質(zhì)量的對數(shù)（lgMW）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用峰面積歸一化法計算相對分子質(zhì)量低于2 000 Da的膠原蛋白肽所占比例。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定。

將最優(yōu)酶解條件下得到的樣品溶液與試劑溶液混合均勻，用分光光度法測定其在517 nm處的吸光度[18]。

1.3.5 膠原蛋白肽飲品的生產(chǎn)操作要點(diǎn)及檢驗分析。

將魚鰾膠原蛋白肽液加入適量的低聚果糖進(jìn)行調(diào)味，以改善其口感，增加其溶解性和透明度[19-20]。調(diào)配后進(jìn)行灌裝扎蓋和濕熱滅菌，制成膠原蛋白肽飲品后，依據(jù)GB 7101—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》分析理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)[21]進(jìn)行檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚鰾膠原蛋白酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.1.1 模型建立與方差分析

對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到相對分子質(zhì)量小于2 000 Da的多肽占比Y的二次回歸編碼方程模型：Y=98.59+1.10X1+0.54X2+0.71X3-0.025X1X2+ 0.26X1X3-0.31X2X3-1.32X12-0.099X22-0.39X32。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

由方程可看出各因素對低于2 000 Da的多肽占比影響程度為酶解溫度X1＞加酶量X3＞酶解時間X2，并且各因素對低于2 000 Da的多肽占比呈正相關(guān)。

由表3方差分析可知：p模型＜0.000 1，表明建立的回歸模型達(dá)到極顯著水平；FLf=0.41，pLf=0.754 6＞0.05，表明失擬項差異不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.988 8，調(diào)整確定系數(shù)Radj2=0.974 4，表明該模型能描述97.44%的響應(yīng)值變化。綜上表明，該模型擬合度高，能較好地解釋各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析

上述回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表明，模型的一次項X1、X3，二次項X12對低于2 000 Da的多肽占比影響極顯著（p＜0.000 1）；一次項X2，二次項X32及交互項X1X3、X2X3對低于2 000 Da的多肽占比影響顯著（p＜ 0.05）；其余項影響均不顯著。

2.1.2 酶解條件的優(yōu)化和驗證。

通過Design-Expert軟件分析，結(jié)合實際生產(chǎn)應(yīng)用，得出酶解魚鰾膠原蛋白的最優(yōu)條件：酶解溫度62 ℃，酶解時間9 h，加酶量2.17%。在此條件下測得相對分子質(zhì)量低于2 000 Da的多肽占比為99.0%，與理論預(yù)測值99.2%只相差0.2個百分點(diǎn)，說明所建立的數(shù)學(xué)模型對膠原蛋白肽的實際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

2.1.3 膠原蛋白肽分子量分布。

在最優(yōu)酶解條件下得到的膠原蛋白肽相對分子質(zhì)量分布色譜圖見圖1。

圖1 膠原蛋白肽相對分子質(zhì)量分布色譜圖

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到膠原蛋白肽液相對分子質(zhì)量的分布范圍，如表4所示。

由表4可知，膠原蛋白肽液相對分子質(zhì)量主要集中在300～1 000 Da，占比為84.23%，相對分子質(zhì)量小于1 000 Da的多肽占比為89.53%，說明在最優(yōu)酶解條件下得到的膠原蛋白肽液主要是小分子肽，能夠有較好的吸收性。

表4 膠原蛋白肽液相對分子質(zhì)量分布

2.2 DPPH自由基清除率的測定結(jié)果

在最優(yōu)酶解條件下得到的魚鰾膠原蛋白肽液對DPPH自由基的清除率為85.4%，與孫燕麗等[15]報道的草魚魚鰾酶解液對DPPH自由基的清除率相比，高出6.5%。說明相對分子質(zhì)量低于2 000 Da的魚鰾膠原蛋白肽液具有較高的抗氧化能力。

2.3 膠原蛋白肽飲品檢測結(jié)果

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤 滋味、氣味 狀態(tài)淡黃色液體 甘甜適口、味道柔和,無異味 清亮透明,無雜質(zhì)

2.3.2 理化指標(biāo)

鉛 (以Pb計)/(mg·L-1) 結(jié)果檢測值 標(biāo)準(zhǔn)＜0.05 ≤0.3 符合要求

2.3.3 衛(wèi)生指標(biāo)

符合商業(yè)無菌的要求。

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶對魚鰾進(jìn)行酶解，利用響應(yīng)面模型對酶解關(guān)鍵因素進(jìn)行探討，得到最優(yōu)酶解參數(shù)：酶解溫度62 ℃，酶解時間9 h，加酶量2.17%。在該條件下制備魚鰾膠原蛋白肽，相對分子質(zhì)量低于2 000 Da的多肽占比為99.0%，此膠原蛋白肽液對DPPH自由基的清除率為85.4%。利用魚鰾膠原蛋白肽液制備的膠原蛋白肽飲品，其產(chǎn)品符合飲料的理化衛(wèi)生指標(biāo)。后續(xù)將研究魚鰾膠原蛋白酶解液復(fù)配其他功效成分，制備具有不同保健功能的飲品。