劉新蕾，周慷，肖洪波，唐宏煒

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科，重慶 400000

淋巴瘤是淋巴結(jié)或淋巴組織的惡性腫瘤，因其臨床表現(xiàn)的多樣性及建立診斷的復(fù)雜性使得該病的診斷具有一定的挑戰(zhàn)性。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）在對淋巴腫瘤性疾病的界定中指出，對淋巴瘤的診斷需要病理形態(tài)學(xué)（活檢、骨髓及血細(xì)胞形態(tài)學(xué)）、免疫組織化學(xué)（免疫表型）、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FC）、細(xì)胞遺傳學(xué)以及結(jié)合臨床表現(xiàn)綜合診斷和多學(xué)科參與[1]。目前，病理學(xué)診斷仍是確診淋巴瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但其有一定的局限性，包括操作復(fù)雜且耗時(shí)長，不能滿足對進(jìn)展快和特殊部位的淋巴瘤快速診斷、及時(shí)治療的要求等。而流式細(xì)胞術(shù)能夠快速識別多種、體量較大的細(xì)胞群，判斷細(xì)胞的克隆性，且耗時(shí)少，可實(shí)現(xiàn)快速診斷[2]。其中，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multipa‐rameter flow cytometry,MFC）在臨床上廣泛用于評估復(fù)雜的細(xì)胞混合物[3]。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)還可用于微小殘留病變（minimal residual disease,MRD）的監(jiān)測，MRD 檢測對血液病患者的治療管理具有顯著影響。MFC-MRD 診斷為表型識別耐藥/復(fù)發(fā)性腫瘤細(xì)胞提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)，為臨床工作者在制訂治療決策時(shí)提供了方向[4]。本文主要介紹流式細(xì)胞術(shù)在成熟B 細(xì)胞腫瘤的應(yīng)用。

1 成熟B 淋巴細(xì)胞腫瘤

B 淋巴細(xì)胞增生性疾?。˙-lineage lymphoprolif‐erative disorders,B-LPD）中普遍存在的CD19 表達(dá)是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的第一個(gè)強(qiáng)制性門控步驟，然后通過輕鏈限制性檢測和抗原錯(cuò)譯表達(dá)（特別是泛T 抗原CD5 的表達(dá)）來確定異常的成熟B 淋巴細(xì)胞[5]。

1.1 CD5+小細(xì)胞成熟B 淋巴細(xì)胞腫瘤

慢性淋巴細(xì)胞白血病/小細(xì)胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma,CLL/SLL），是一種由單克隆成熟小B 細(xì)胞組成的B細(xì)胞腫瘤[6]。通過血液流式細(xì)胞術(shù)足以診斷CLL/SLL，通常不需要活組織檢查。CLL/SLL 的免疫表型通常為一種輕鏈限制性表達(dá)（kappa 或lambda）和B 細(xì)胞抗原受體（B-cell antigen receptor,BCR）相關(guān)復(fù)合物的弱表達(dá)。典型的CLL/SLL 免疫表型包括：CD5+、CD23+、CD43+/-、CD10–、CD19+、CD20 弱陽性、slg 弱陽性、cyclinD1–。需要注意的是，某些病例可能是slg 強(qiáng)陽性，CD23-或弱陽性，有些套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）可能出現(xiàn)CD23+，因此，在所有CLL/SLL 患者中應(yīng)考慮進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測cyclinD1 或FISH 檢測t（11，14），并且應(yīng)該在具有非典型免疫表型（即CD23 弱陽性或陰性、CD20+、sIg+）的患者中進(jìn)行[7]。CD200 是鑒別CLL 和MCL 的較特異的免疫表型，CD200 對CLL 的敏感性很高[8]，CLL 的研究幾乎普遍顯示，CD200 陽性率高于97%，大多數(shù)報(bào)告接近99%，而在MCL 的CD200的表達(dá)普遍為陰性。一旦CLL/SLL 的診斷成立，對預(yù)后標(biāo)志物的檢測十分重要。目前普遍接受的能夠預(yù)測CLL 患者預(yù)后的指標(biāo)包括免疫球蛋白重鏈可變（immunoglobulin heavy chain variable,IGHV）基因、CD49d 和ZAP-70/CD38 表達(dá)的體細(xì)胞突變，以及染色體異常（染色體13q、17p 和11q 缺失以及12三體）和TP53、ATM、NOTCH1、BIRC3 和SF3B1 基因復(fù)發(fā)突變的鑒定[9]。不表達(dá)ZAP-70 或CD38 的CLL/SLL 患者預(yù)后更好[10]。沒有免疫球蛋白重鏈可變基因（immunoglobulin heavy chain variable region,IgVH）突變的CLL 患者中白血病細(xì)胞表達(dá)高水平的ZAP-70，而具有IgVH 突變的CLL 患者中白血病細(xì)胞幾乎不表達(dá)ZAP-70[11]。在一線治療中，非突變重鏈基因?qū)TK 抑制劑的反應(yīng)比化療更好[12]。與ZAP-70 流式細(xì)胞術(shù)評估相比，CD49d 檢測容易區(qū)分陽性和陰性患者，從而實(shí)現(xiàn)可靠的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層[9]。治療期間和治療后可測量的殘留病灶（measurable re‐sidual lesions,MRD）的準(zhǔn)確量化對于預(yù)測CLL 治療的臨床結(jié)果至關(guān)重要。MRD 是化學(xué)免疫療法和同種異體移植后無進(jìn)展生存期（progression free sur‐vival,PFS）和總生存期（overall survival,OS）的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，可用于決定低風(fēng)險(xiǎn)遺傳學(xué)患者何時(shí)停止治療，目前已成為評估臨床終點(diǎn)前隨機(jī)試驗(yàn)治療效果的一個(gè)公認(rèn)替代指標(biāo)[13]。

套細(xì)胞淋巴瘤來源于淋巴濾泡外套區(qū)生發(fā)中心前的B 細(xì)胞，臨床上多數(shù)患者表現(xiàn)為Ⅲ或Ⅳ期，常常累及骨髓和外周血，免疫表型較特異，結(jié)合標(biāo)志性細(xì)胞遺傳學(xué)/分子生物學(xué)檢測可以確診。通常具有標(biāo) 志性的t（11，14）（q1，q32）染色體異位、CCND1 基因與免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin heavy chain,IGH）基因座，引起促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期蛋白D1 的過度表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂和侵襲性淋巴瘤的形成。作為B 細(xì)胞淋巴瘤，MCL 表達(dá)CD19、CD20、CD21、CD22、CD79a、表面Ig（通常為IgM 和IgD）、FMC-7、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2,BCL-2）、CD23 和CD200 陰性[2]。CD19 和CD20 之間的表達(dá)強(qiáng)弱與CLL 相反，具有一定的鑒別意義。但也有CD23 陽性的報(bào)道，Saksena Annapurna 等[14]報(bào)告103 例（13%）MCL 患者CD23 弱陽性。CD23+MCL 淋巴瘤患者有白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加、骨髓受累和白血病表現(xiàn)。值得注意的是，CD23+MCL 通常與CD200+和弱SOX11 表達(dá)相關(guān)。盡管CD23+MCL 患者的白血病表現(xiàn)與CLL 相似，但其預(yù)后優(yōu)于CD23-患者。另外，Vockova Petra 等[15]的研究指出CD31 與結(jié)外/髓外受累（E/E）的參與程度呈正相關(guān)。CD31 的高表達(dá)可能促進(jìn)E/E 組織中MCL 細(xì)胞的擴(kuò)散、植入和/或存活。

1.2 CD5-成熟B 淋巴細(xì)胞腫瘤

WHO 定義淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤（Lymphoplasma‐cytic lymphoma,LPL）是由小B 淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞組成的淋巴瘤，常侵犯骨髓，也侵犯淋巴結(jié)和脾臟，且不符合其他可能伴漿細(xì)胞分化的小B 細(xì)胞淋巴瘤[6]。當(dāng)LPL 侵犯骨髓且伴單克隆IgM 血癥（不論數(shù)量）時(shí)，則應(yīng)診斷為華氏巨球蛋白血癥（waldenstrfim macroglobulinemia,WM），LPL最重要的特征是具有MYD88 L265P 突變[16]。WM是一種少見的以血清單克隆IgM 為主要特征的惰性淋巴細(xì)胞腫瘤[17]。其免疫表型通常為CD19+、CD20+、CD22+、CD25+、CD27+、FMC7+、CD5+/-、CD10-、CD23-、CD103-。10%～20% 的患者 可部分表達(dá)CD5、CD10、CD23，此時(shí)不能僅憑免疫表型排除WM[18]?？梢娖淞馨土龅某煞直容^復(fù)雜，抗原表達(dá)上具有高度特異性，表達(dá)B 細(xì)胞相關(guān)抗原有漿細(xì)胞成分時(shí)可有CD138 的表達(dá)。因此，流式細(xì)胞術(shù)對LPL/WM 有輔助診斷的價(jià)值，確診需要聯(lián)合單克隆IgM、骨髓形態(tài)以及MYD88 基因檢測。

濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma,FL）通常是一種由濾泡中心B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成的惰性B 細(xì)胞淋巴增生性疾病。FL 的臨床表現(xiàn)不具特征性，需經(jīng)淋巴結(jié)病理活檢確診，流式細(xì)胞術(shù)僅作為輔助診斷方式。幾乎所有FL 均為CD19、CD20、CD22、CD79a 和CD10 陽性（60%），且缺乏CD5、CD43（大多數(shù)病例）和CD11c 的表達(dá)[14,19]。FL 流式細(xì)胞術(shù)的免疫表型分析通常顯示CD10+B 細(xì)胞表達(dá)單克隆免疫球蛋白輕鏈，而免疫組織化學(xué)通常顯示濾泡被CD10+、BCL6+、BCL2+B 細(xì)胞占據(jù)。在85%～90%的濾泡性淋巴瘤中，疾病進(jìn)展過程中存在BCL2 重排，導(dǎo)致BCL2 過度表達(dá)[1,5]。

毛細(xì)胞白血病（hairy cell leukemia,HCL）是一種少見的慢性克隆性B 細(xì)胞增殖性疾病，患者多無癥狀，以貧血、出血、肝脾腫大即外周血及骨髓出現(xiàn)大量邊緣不齊呈偽足或纖毛樣突出的白細(xì)胞為特征[20]。HCL 具有高頻率IGHV 突變的克隆B 細(xì)胞和較常見的BRAF V600E 突變。因HCL 具有較為獨(dú)特的免疫表型，其診斷通常通過骨髓活檢和流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)顯示HCL 具有高水平的CD19、CD20 和CD22 的表達(dá)，同時(shí)常表達(dá)CD11c、CD103 整合素、CD25 以及CD123，CD5、CD23、CD10 和CD27呈陰性或弱表達(dá)[21]。CD11c、CD25、CD103 和CD123可用于區(qū)分HCL 和其他B 細(xì)胞疾病。其他標(biāo)記物，如CD27、CD43、CD81 和CD200 在HCL 和HCL-V 中的表達(dá)不同，反映其不同的疾病生物學(xué)特性[22]。CD27 和CD38 在經(jīng)典HCL 中通常為陰性，這使其區(qū)別于其他淋巴增生性疾病[23]。因毛細(xì)胞白血病獨(dú)特的免疫表型，可利用免疫組織化學(xué)（Immunohisto‐chemistry,IHC）和MFC 評估MRD。

B 幼淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell prolymphocytic leu‐kemia,B-PLL）是一種罕見的B 細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞增生性疾?。˙-cell chronic lymphoproliferative dis‐ease,BCLPD），PLL 的顯著特征是具有核染色質(zhì)濃集卻有大而明顯的單個(gè)核仁，特異性的形態(tài)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FC）仍然是診斷B-PLL 的可靠方法。PLL 表型特征包括有或沒有SIgD、CD19、CD20、CD22、人類白細(xì)胞DR 抗原（human leu‐kocyte antigen DR,HLA-DR）、CD79b、FMC7 的表達(dá)和克隆型Ig 輕鏈強(qiáng)表達(dá)，但缺少CD5 和CD23 的表達(dá)[24]。盡管CLL 和B-PLL 通常能夠通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行區(qū)分（最有用的標(biāo)記物為CD79b、SIgM、CD200、CD27、CD39 和CD5），但與MCL 和B-PLL 的標(biāo)記物仍有部分重疊。

邊緣區(qū)淋巴瘤（marginal zone lymphoma,MZL）是惰性B 細(xì)胞淋巴瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的10%。MZL 的特征是從黏膜相關(guān)淋巴組織（mucosa associated lymphoid tissue,MALT）、淋巴結(jié)和脾臟中發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞濾泡邊緣區(qū)增殖。在最近的WHO 分類中將其分為3 種不同的類型：黏膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤（MALT 淋巴瘤）、脾臟MZL（SMZL）和淋巴結(jié)MZL（NMZL）。MALT 淋巴瘤細(xì)胞顯示泛B 細(xì)胞標(biāo)記，如CD19、CD20 和CD79a，同時(shí)淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)邊緣帶相關(guān)抗原CD21 和CD35，而CD5、CD10、CD23 和細(xì)胞周期蛋白D1 呈陰性表達(dá)，這有助于區(qū) 分MZL 與CLL/SLL、FL 和MCL。然 而，約20%～25%的MZL 可表達(dá)CD5[25]，這種抗原的表達(dá)通常與淋巴細(xì)胞增多和彌漫性骨髓浸潤相關(guān)，但不影響預(yù)后。SMZL 免疫組化顯示成熟的B 淋巴細(xì)胞表達(dá)CD20 和CD79，不表達(dá)cyclinD1、CD10 和BCL6。流式細(xì)胞術(shù)檢測到SMZL 細(xì)胞為CD24+、CD27+和FMC7+。典型的CD22 和CD11c 染色，但不如其他脾淋巴瘤（SDRPL 或HCL）明亮。CD123 為陰性，在極少數(shù)情況下CD103 可能為微弱陽性。免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)均提示膜聯(lián)蛋白A1 和CD25 為陰性。另外，在流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)組中添加CD180 可以更好地對成熟B 淋巴瘤進(jìn)行分類，其對MZL 的敏感性和特異性分別為75%和90%[26]，這也使CD180 成為MZL 中有用的免疫標(biāo)記物。此外，高強(qiáng)度的CD180 染色可能有利于診斷起源于脾的淋巴瘤，因?yàn)镾MZL 和脾臟彌漫紅髓小B 細(xì)胞淋巴瘤（SDRPL）在流式細(xì)胞術(shù)中顯示出特別高水平的CD180 表達(dá)[27]。

1.3 彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lym?phoma，DLBCL）

彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤是最常見的非霍奇金淋巴瘤，具有侵襲性，患者通常表現(xiàn)為淋巴結(jié)迅速擴(kuò)大和全身癥狀，需要立即治療。形態(tài)學(xué)上，DLBCL 的特征是彌漫性浸潤中大型細(xì)胞，核仁大，細(xì)胞質(zhì)豐富，破壞并抹去受累淋巴結(jié)的基本結(jié)構(gòu)[28]。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析該腫瘤無特征性免疫表型，DLBCL 通常表達(dá)泛B 細(xì)胞抗原，包括CD19、CD20、CD22、CD79a 和CD45。大多數(shù)細(xì)胞也表達(dá)表面免疫球蛋白（immunoglobulin,IG）。Espasa Andrea等[29]檢測CD71、CD81、CD44 和CD39 在B 細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)時(shí)指出，CD71 的高表達(dá)提示大細(xì)胞淋巴瘤，尤其是在CD10 陰性的情況下，CD10 陰性DLBCL 中CD39 高表達(dá)，CD10 陽性DLBCL/HGBL 中CD39 低表達(dá)。Stacchini Alessandra 等[30]報(bào)道了5 例CD56+DLBCL，其起源于生發(fā)中心，明顯傾向于結(jié)外受累。根據(jù)他們的發(fā)現(xiàn)和文獻(xiàn)資料，CD56 表達(dá)似乎優(yōu)先與生發(fā)中心起源的B 淋巴瘤相關(guān)。盡管FCM 在大B 細(xì)胞淋巴瘤中的診斷作用有限，但流式分析可以快速找到組織中的克隆性B 細(xì)胞，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和臨床侵襲性過程能盡早明確診斷，為部分患者爭取治療的時(shí)間。同時(shí)，一項(xiàng)系統(tǒng)評價(jià)指出DLBCL 中CD30 陽性的表達(dá)可能與更高的存活率和更好的預(yù)后相關(guān)，也為這部分患者提供新的治療靶點(diǎn)[31]。2017 年WHO 分類要求將彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤，非特殊性分型（DLBCL,NOS）分為生發(fā)中心B細(xì)胞型（GCB）或非GCB 類型，通過CD20、CD10、bcl-6 和MUM-1（IRF4）的表達(dá)與否來確定彌漫大B細(xì)胞起源于GCB 還是非GCB。一般認(rèn)為CD10+/-，BCL-6+，MUM1-為GCB，其余為非GCB[28]。

1.4 伯基特淋巴瘤（burkitt lymphoma，BL）

伯基特淋巴瘤臨床侵襲性強(qiáng)，通常以結(jié)外受累或急性白血病的形式出現(xiàn)。目前無單一參數(shù)能作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。BL 來源于生發(fā)中心B 細(xì)胞，其發(fā)育依賴于MYC 基因的表達(dá)，該基因編碼c-myc 蛋白轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子位于染色體8q24 上并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡[32]。組織學(xué)上，BL 通常呈彌漫的生長方式，BL 表現(xiàn)出“滿天星”圖像，瘤細(xì)胞間有散在的組織細(xì)胞分布。通常能觀察到較高的增殖率和細(xì)胞凋亡率，即高分裂指數(shù)和高凋亡的特征性病變。免疫表型檢測，BL 細(xì)胞表達(dá)膜IgM，有輕鏈限制性以及B 細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志（CD19、CD20、CD22等）和生發(fā)中心標(biāo)志（CD10、BCL6）。CD38、CD43 的陽性率也較高。幾乎全部的BL 強(qiáng)表達(dá)MYC 蛋白（所有細(xì)胞），高增殖活性KI67 大于90%。腫瘤細(xì)胞通常不表達(dá)CD5、CD23、CD138、BCL2 和TdT[33]。流式細(xì)胞術(shù)能快速得到結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)表現(xiàn)大致可以推斷BL 的診斷，為高度進(jìn)展患者及時(shí)治療提供有力的證據(jù)。

2 總結(jié)與展望

淋巴瘤是一類高度異質(zhì)性的腫瘤，其臨床表現(xiàn)差異大，對于大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤，形態(tài)學(xué)/細(xì)胞學(xué)特征的知識對于鞏固綜合診斷和指導(dǎo)進(jìn)一步的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子研究是非常重要的，流式細(xì)胞術(shù)更是診斷各種樣本中血液系統(tǒng)腫瘤的一種快速有效的工具，也是建立B 細(xì)胞克隆性最方便、最有力的手段之一，因此，以臨床為基礎(chǔ)的多學(xué)科綜合診斷治療是未來淋巴瘤診治的發(fā)展方向。