沈 芹，徐寧，黃晉博，倪松石

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南通 226001)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)，定義為右心導(dǎo)管測量肺動脈壓平均≥25 mmHg，同時肺小動脈楔壓≤15 mmHg 及肺血管阻力＞3 Wood單位，是多種復(fù)雜因素導(dǎo)致的血流動力學(xué)障礙性疾病[1]。未經(jīng)治療的PAH 會持續(xù)進(jìn)展，出現(xiàn)慢性肺源性心臟病，右心代償性肥厚和右心衰竭[2]。盡管在潛在治療靶點和引入新藥的知識方面取得了進(jìn)展，但5年生存率仍然很低[3]。近年來，探討PAH 發(fā)病機(jī)制的主要研究集中在代謝途徑的差異調(diào)控上。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)屬于一種糖蛋白，主要存在于細(xì)胞表面，能與大多數(shù)脂肪酸發(fā)生特異性結(jié)合[4]。多項研究[5-7]表明，CD36 介導(dǎo)的脂肪酸代謝在口腔癌、宮頸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。CD36 缺乏可降低人類和小鼠心臟、骨骼肌和脂肪組織對脂肪酸的吸收[8]。因此，推測CD36 可通過脂肪酸代謝途徑影響PAH 的發(fā)生發(fā)展。本文通過探究CD36 對人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAEC)的作用及其機(jī)制，探討CD36 及其下游通路對PAH 的作用，為其可能的靶點提供理論依據(jù)，為PAH 的治療奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 資料收集 納入標(biāo)準(zhǔn)：本研究收集2021 年1月—2022 年1 月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院確診為PAH的患者20 例，其中男8 例，女12 例，年齡30～65 歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2021 年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會肺栓塞與肺血管病學(xué)組的《中國肺動脈高壓診斷與治療指南》，根據(jù)住院患者心臟彩色多普勒超聲的檢查結(jié)果分為輕度PAH：31～＜50 mmHg，中度：50～＜70 mmHg，重度：≥70 mmHg。正常人樣本由20 名健康成年志愿者捐獻(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、急慢性心功能不全、動脈栓塞、腦血管意外、急慢性肝炎、間質(zhì)性肺病等疾病的患者，依從性差的患者。血液樣本均自肘靜脈抽取，置于枸櫞酸鈉抗凝管中。本研究均經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理號：2020-L088)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 CD36 抗體、β-actin 抗體(美國CST)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物(南通翱翔生物)，胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國)，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher，美國)，細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK8)(BiosharP 生物)，凋亡試劑盒(南京福麥斯生物)，CD36 過表達(dá)病毒、CD36 干擾病毒(上海吉凱基因)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 收集血清樣本，測試前未予藥物治療，早晨空腹時間收集血液，室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心20 min，收集上層液體至清潔EP 管，加入Biotin-Conjugated Antibody，酶標(biāo)儀讀取450 nm 處吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線使用Excel 計算得出CD36 質(zhì)量濃度。

1.4 HPAEC 培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HPAEC 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞資源庫。HPAEC 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，置入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后(48～72 h)換液。取對數(shù)生長期的2×104個HPAECs 細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別加入對應(yīng)的病毒，并添加適當(dāng)?shù)牟《靖腥驹噭D(zhuǎn)染6 h 后換液培養(yǎng)。

1.5 CCK8 增殖實驗 消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔約2 000 個細(xì)胞，按100 μL/孔的標(biāo)準(zhǔn)把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96 孔板內(nèi)。及時吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞充分混勻。96 孔板最外側(cè)一圈加基礎(chǔ)培養(yǎng)基；共設(shè)置對照組、CD36 敲減組、CD36 過表達(dá)組，并設(shè)置多個復(fù)孔，共設(shè)置4 塊96 孔板。觀察細(xì)胞狀態(tài)，分別于貼壁0、24、48、72 和96 h 把CCK8 添加至細(xì)胞內(nèi)，在450 nm 處對每孔吸光度進(jìn)行檢測，測定各孔的吸光度(optical density,OD)值。時間為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.6 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48 h，收集細(xì)胞并提取核酸，進(jìn)行qRT-PCR 分析。以上實驗重復(fù)3 次，對其平均值進(jìn)行計算。

1.7 Western Blot 分析 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，定量蛋白濃度，進(jìn)行Western Blot 檢測，抗體為抗βactin 抗體、抗CD36 抗體，曝光后進(jìn)行灰度掃描，記錄目的蛋白相對表達(dá)量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞重懸，約100 μL，加10 μL 20 μg/mL 的碘化丙啶溶液和5 μL Annexin V/AlexaFluor 647，混勻后于室溫孵育15 min(嚴(yán)格避光)。在反應(yīng)管中加適量磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(根據(jù)具體細(xì)胞密度調(diào)整，細(xì)胞密度大，則PBS 量多；細(xì)胞密度低，則PBS量少)，流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中CD36 質(zhì)量濃度 正常人及PAH 患者的血清中CD36 質(zhì)量濃度分別為(20.01±1.01) pg/μL、(14.62±0.82) pg/μL，PAH 患者血清中CD36 質(zhì)量濃度顯著低于正常人(P＜0.05)。

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定敲減及過表達(dá)CD36 的HPAEC

2.2.1 轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染3 d 后，使用顯微鏡查看細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)綠色熒光的多少及強(qiáng)弱初步判斷轉(zhuǎn)染效率的高低，結(jié)果可見病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞率達(dá)90%以上(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染3 d 后HPAEC 的熒光表達(dá)情況

2.2.2 轉(zhuǎn)染后HPAEC 中CD36 蛋白及mRNA的表達(dá)情況 Western Blot 檢測各組CD36 的蛋白表達(dá)水平，敲減組CD36 蛋白表達(dá)降低，過表達(dá)組CD36 蛋白表達(dá)升高，提示細(xì)胞株轉(zhuǎn)染成功(圖2A～B)；轉(zhuǎn)染CD36 敲減慢病毒的細(xì)胞株中，CD36 mRNA 表達(dá)量較對照組顯著降低；轉(zhuǎn)染CD36 過表達(dá)慢病毒的細(xì)胞株中，CD36 mRNA 表達(dá)量較對照組顯著增高(圖2C)。

圖2 各組轉(zhuǎn)染后CD36 的蛋白及mRNA 表達(dá)水平變化

2.3 CD36 敲減和過表達(dá)對細(xì)胞凋亡和增殖的影響流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)CD36 敲減組中的細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組(P＜0.05)，而CD36 過表達(dá)組凋亡率顯著增加，提示過表達(dá)CD36 對HPAEC 有一定的促凋亡作用(圖3A～B)。CCK8 法結(jié)果顯示過表達(dá)CD36 組HPAEC 細(xì)胞增殖速度較對照組顯著減慢(圖3C)，提示CD36 過表達(dá)抑制了HPAEC 的增殖。

圖3 CD36 敲減和過表達(dá)CD36 對HPAEC 細(xì)胞凋亡和增殖的影響

3 討 論

PAH 患者的臨床表現(xiàn)差異較大，通常早期無特異性癥狀，僅在活動后出現(xiàn)胸悶、氣短等癥狀。因PAH 癥狀缺乏特異性，其診斷較為困難，很多患者診斷時已出現(xiàn)右心功能不全。右心導(dǎo)管檢查是診斷PAH 的金標(biāo)準(zhǔn)，但為有創(chuàng)檢查，有并發(fā)癥甚至死亡的風(fēng)險，需送往有經(jīng)驗的PAH 診療中心，進(jìn)一步增加了PAH 的診斷困難[9]。而現(xiàn)在臨床針對PAH 應(yīng)用的藥物大多是延緩血管重構(gòu)和右心功能不全，很難從根本上治愈PAH。因此尋找新的生物標(biāo)志物與治療靶點，對于PAH 的診斷和治療顯得尤為重要。

越來越多的證據(jù)[10]表明，脂肪酸氧化和氨基酸分解的代謝變化與PAH 的形成有關(guān)。新出現(xiàn)的證據(jù)指向PAH 的代謝理論，表明PAH 是由抑制線粒體呼吸和葡萄糖氧化(稱為癌癥代謝中的Warburg 效應(yīng))引起的。它使細(xì)胞迅速增殖而不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，并加速PAH 中的血管重塑[11-12]。在Warburg 效應(yīng)期間的各種代謝變化對于PAH 的發(fā)生和維持也是必不可少的[12-13]。此外，涉及脂肪酸氧化和氨基酸分解的代謝變化也被認(rèn)為與PAH 的形成有關(guān)[14]。對這些途徑的更深入理解有可能為PAH 的診斷和治療提供靶點。

本研究提供了對PAH 代謝特征的見解，有可能揭示新的生物標(biāo)志物和治療靶點。在本研究中，參與脂肪酸和葡萄糖代謝的重要分子CD36，在PAH 患者血清中表達(dá)水平顯著降低，表明CD36 有可能通過脂肪酸代謝途徑參與PAH 的發(fā)展過程。為進(jìn)一步探索CD36 在PAH 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，通過構(gòu)建敲減及過表達(dá)CD36 的HPAEC，發(fā)現(xiàn)CD36 敲減組HPAEC 凋亡率顯著下降，而CD36 過表達(dá)組HPAEC凋亡率顯著增加，細(xì)胞增殖能力顯著降低。

綜上所述，代謝異常與PAH 的形成密切相關(guān)，而CD36 影響PAH 形成的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。