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miR-30a-3p/OCT-1調(diào)控肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制研究

2022-03-14 01:24賀松琴陳瀟李因茵榮光華葉映泉聞炳基羅家玉
關(guān)鍵詞:小室細(xì)胞培養(yǎng)引物

賀松琴,陳瀟,李因茵,榮光華,葉映泉,聞炳基,羅家玉

目前,肝細(xì)胞癌(HCC)抗腫瘤藥物治療的主要策略是使用分子靶向藥物(MTAs),其中索拉非尼(Sorafenib)在臨床已得到廣泛應(yīng)用,但患者普遍存在明顯耐藥及較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)[1]。目前全球各種新型的分子靶向藥物,如瑞戈非尼(Regorafenib)、侖伐替尼/樂伐替尼(Lenvatinib)以及卡博替尼(Cabozantinib)等均批準(zhǔn)用于進(jìn)展期HCC治療[2]。這些藥物與Sorafenib均有相同的化學(xué)機(jī)構(gòu)母核{(lán)1-[4-(pyridin-4-yloxy)phenyl]urea},臨床易出現(xiàn)與Sorafenib類似的耐藥現(xiàn)象或毒副反應(yīng)。

轉(zhuǎn)錄因子OCT-1是Pit-Oct-Unc(POU)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,能夠通過與八聚體序列(AGTCAAAT)基序(motif)結(jié)合,介導(dǎo)其下游基因的轉(zhuǎn)錄,在包括HCC在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲等重要生理過程中發(fā)揮了重要作用[3]。microRNA是一類由RNA聚合酶II(RNAPol II)轉(zhuǎn)錄的小分子非編碼RNA,能夠通過序列特異的方式作用于目標(biāo)基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)降解目的基因的mRNA,最終誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)沉默[4]。因此,利用微小RNA(miR)的表達(dá)載體特異性沉默癌基因的表達(dá)是有效的抗腫瘤治療策略[5]。為此,本研究首先使用在線生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)可能作用于OCT-1的miR-30a-3p,再利用化學(xué)合成的方法構(gòu)建pre-miR-30a-3p的慢病毒表達(dá)載體,在此基礎(chǔ)上制備包括pre-miR-30a-3p全序列的慢病毒,檢測(cè)miR-30a-3p對(duì)HCC細(xì)胞中OCT-1的影響以及對(duì)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移與耐藥的調(diào)控作用。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)備(1)細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)耗材:高侵襲性HCC細(xì)胞系MHCC97-H(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)等為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;60及90 mm直徑細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞培養(yǎng)瓶及6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,均為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品;預(yù)裝-預(yù)滅菌的移液器吸頭(包括1000-200、200-20以及1~20l量程)均為美國(guó)Axygen公司產(chǎn)品;Transwell培養(yǎng)板、小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品;陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。(2)試劑盒:RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒等均為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;分子生物學(xué)使用的各類載體均購買自山東維真公司(Vigene);載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)使用的各種工具酶類,包括限定性內(nèi)切酶和DNA鏈接酶為英國(guó)NEB公司產(chǎn)品。(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:4~6周齡的胸腺缺失(T細(xì)胞缺失)的免疫缺陷小鼠購買自北京斯貝福公司,在SPF清潔條件下進(jìn)行飼養(yǎng);60Co-預(yù)照射滅菌的鼠糧、墊料等購買自軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;其余動(dòng)物手術(shù)使用的各式器材,包括針持、縫合針、縫合線、粘鼠板、超凈手術(shù)工作臺(tái)等均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)器材。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用的恒溫恒濕CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品;細(xì)胞觀察實(shí)驗(yàn)使用的倒置相差顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品;定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)實(shí)驗(yàn)使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品(ABI7500);系列量程的移液器為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;其余設(shè)備,包括臺(tái)式離心機(jī)、冰箱等均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)設(shè)備;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺(tái)為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)保障與提供。

1.2 研究方法

1.2.1 miR預(yù)測(cè)與載體構(gòu)建 查詢可知OCT1的Gene Symbol為POU2F1,使用在線工具miRDB對(duì)作用于POU2F1的miRs進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合預(yù)測(cè)評(píng)分和人工判讀即選取評(píng)分最高的miR:miR-30a-3p為OCT-1的調(diào)控分子。在此基礎(chǔ)上在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索得到hsa-pre-miR-30a-3p的全序列,通過化學(xué)合成的方法獲得包含有半酶切位點(diǎn)的miR-30a-3p的正義與反義序列,二者使用PCR以獲得雙鏈DNA片段。在此基礎(chǔ)上依據(jù)has-pre-miR-30a-3p的半酶切位點(diǎn)對(duì)慢病毒載體(pLV)進(jìn)行酶切后與所獲得的miR-30a-3p進(jìn)行連接,最終獲得miR-30a-3p的慢病毒載體并包裝獲得miR-30a-3p的慢病毒顆粒;將包含有野生型的OCT-1全序列或突變的miR-30a-3p作用位點(diǎn)的OCT-1全序列克隆至pLV載體上,再包裝為慢病毒顆粒。

1.2.2 定量PCR實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Liang等[6]方法實(shí)驗(yàn),在MHCC97-H細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組、miR-30a-3p以及miR-30a-3p+OCT-1Mut后,收集MHCC97-H細(xì)胞提取總RNA樣品,對(duì)樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行qPCR檢測(cè)。以目標(biāo)基因相對(duì)于內(nèi)參基因(-Actin)的表達(dá)水平計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。(1)OCT-1正向引物5’-GAAACGCACCAGCATAGAGACC-3’,反向引物

5’-GGCGGTTACAGAACCAAACACG-3’;(2)Cyclin D1(ccnd1)正向引物5’-TCTACACCGACAA CTCCATCCG-3’,反向引物5’-TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG-3’;(3)abcb1正向引物5’-GCTGTCAAGGAAGCCAATGCCT-3’,反向引物5’-TGCAATGGCGATCCTCTGCTTC-3’;(4)abcg2正向引物5’-GTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTT-3’,反向引物5’-TCCTCCAGA CACACCACGGATA-3’;(5)snail正 向 引 物 5’-TCAGACGAGGACAGTGGGAAAG-3’,反向引物5’-GCTTGTGGAGCAGGGACATTC-3’;(6)twist正 向 引 物5’-GTACATCGACTTC CTCTACCAG-3’,反向引物5’-CATCCTCCAGACCGAGAAG-3’;(7)內(nèi)參-actin正向引物5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’,反向引物5’-AGGTCTTTGCGGAT GTCCACGT-3’。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Fan等[4]方法實(shí)驗(yàn),在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體(control miRNA或miR-30a-3p)后,再使用不含有血清的DMEM培養(yǎng)基收集細(xì)胞并重懸細(xì)胞制備為細(xì)胞懸液,再將制備所得的細(xì)胞懸液細(xì)胞接種于Transwell板的小室中(每孔接種約20 000個(gè)細(xì)胞)。在這一過程中(即Transwell實(shí)驗(yàn)),對(duì)于轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),細(xì)胞懸液直接接種在Transwell板的小室中;對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn),首先在小室中預(yù)鋪一層ECM膠模擬組織的基底膜,再將MHCC97-H細(xì)胞懸液接種在小室中。此后,在Transwell板外室(即24孔板)中加入含有10%FBS的DMEM后孵育小室(即將前述添加有細(xì)胞懸液的Transwell細(xì)胞小室放入到24孔板中,使小室底部浸潤(rùn)在24孔板內(nèi)容納的包含有10%FBS的DMEM中;侵襲實(shí)驗(yàn)在37℃孵育14~16 h;轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)在37℃孵育6~8 h),此后以結(jié)晶紫試劑(0.5%w/v)對(duì)單克隆進(jìn)行染色。

1.2.4 細(xì)胞單集落形成實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Feng等[7]方法實(shí)驗(yàn),在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體(control miRNA或miR-30a-3p)后收集細(xì)胞,將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。經(jīng)過3~4周的生長(zhǎng),MHCC97-H細(xì)胞能夠形成單克隆,此時(shí)使用結(jié)晶紫試劑(0.5%w/v)對(duì)單克隆進(jìn)行染色,使用Image J軟件對(duì)單克隆的照片進(jìn)行定量分析,依據(jù)克隆總面積相對(duì)于6孔板孔的總面積確定各組克隆的數(shù)量,再依據(jù)對(duì)照組為單位1計(jì)算相對(duì)克隆數(shù)量。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Chen等[8]方法實(shí)驗(yàn),MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體(control miRNA或miR-30a-3p)后再收集細(xì)胞,使用系列劑量的分子靶向藥物處理細(xì)胞約48 h,此后細(xì)胞中添加50 mmol/L的MTT試劑,孵育4~6 h后棄去培養(yǎng)基以10%SDS裂解細(xì)胞裂解液在490 nm處讀取吸光度值,依據(jù)O.D.490 nm計(jì)算藥物作用的抑制率,并依據(jù)抑制率計(jì)算藥物作用的半數(shù)抑制率(IC50值)。

1.2.6 藥物代謝與清除檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Feng等[9]方法實(shí)驗(yàn),MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體(control miRNA或miR-30a-3p)后再以1mol/L劑量的Sorafenib處理細(xì)胞約12 h,此后棄去培養(yǎng)基上清換成正常DMEM培養(yǎng)基,在系列時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、24、48及72 h時(shí)點(diǎn))收集細(xì)胞樣品進(jìn)行超聲破碎,再使用有機(jī)溶劑(乙腈)將細(xì)胞樣品中的Sorafenib萃取出來,再使用液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)系列時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品中Sorafenib的含量并計(jì)算藥物在MHCC97-H細(xì)胞中的半衰期。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 9.0軟件分析,計(jì)量資料采用Bonferroni校正行方差分析,使用Origin統(tǒng)計(jì)分析軟件確定藥物作用于細(xì)胞的半數(shù)作用濃度(IC50 values)或藥物在細(xì)胞中的存留的半衰期。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR抑制其表達(dá) 在OCT-1的3’UTR區(qū)域存在兩個(gè)miR-30a-3p的作用位點(diǎn);miR-30a-3p能夠下調(diào)MHCC97-H細(xì)胞中OCT-1的mRNA表達(dá)水平;miR-30a-3p不能夠抑制3’UTR區(qū)域中miR-30a-3p作用位點(diǎn)突變的OCT-1,此時(shí)在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染OCT-1突變體,能夠恢復(fù)細(xì)胞中OCT-1的表達(dá)。見封二彩圖1。

圖1 miR-30a-3p作用于OCT-13’UTR的位點(diǎn)序列信息

miR-30a-3p能夠下調(diào)OCT-1下游基因的表達(dá)水平,其中包括:(1)下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因Cyclin D1表達(dá)(P<0.05);(2)下調(diào)細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)基因Snail和Twist(均P<0.05);(3)下調(diào)細(xì)胞耐藥相關(guān)基因ABCB1/MDR-1以及ABCG2/BRCP等(均P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-30-3p下調(diào)OCT-1及其下游基因的表達(dá)水平

2.2 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR抑制MHCC97-H細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲 在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30a-3p能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移與侵襲作用,同時(shí)在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30a-3p的同時(shí)轉(zhuǎn)染OCT-1的突變體則能夠抑制miR-30a-3p的作用。見封二彩圖2a~b。

圖2 miR-30a-3p抑制MHCC97-H細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲作用

MHCC97-H細(xì)胞能夠突破裸鼠肝包膜進(jìn)而侵襲進(jìn)入裸鼠肝臟。在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30a-3p能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟臟器的侵襲作用,而在MHCC97-H細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染OCT-1突變體則能夠抑制miR-30a-3p對(duì)于MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠肝臟原位侵襲作用的抗腫瘤活性。見封二彩圖2a、c。

2.3 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR上調(diào)MHCC97-H細(xì)胞對(duì)分子靶向藥Sorafenib的敏感性

在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30a-3p能夠顯著延緩Sorafenib在MHCC97-H細(xì)胞中的代謝與清除作用,Sorafenib的半衰期顯著延長(zhǎng):對(duì)照組為(25.31±7.99)h,miR-30a-3p組為(43.02±6.67)h。而在MHCC97-H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染OCT-1突變體則能夠抑制miR-30a-3p的作用:miR-30a-3p+OCT-1Mut組Sorafenib的半衰期為(20.55±10.75)h。

圖3 miR-30a-3p能夠上調(diào)Sorafenib對(duì)MHCC97-H細(xì)胞的殺傷作用

3 討論

受診療技術(shù)的限制,HCC患者往往初診即為進(jìn)展期。由于進(jìn)展期HCC具有對(duì)傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療藥物多藥耐藥的特性,因此常見化療藥物如阿霉素等在HCC治療中少有應(yīng)用,僅能夠應(yīng)用于經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)等少數(shù)特殊治療策略。因此分子靶向治療在HCC治療中具有重要意義。盡管有大量臨床試驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)研究,但仍然僅有Sorafenib等4種分子靶向藥物最終獲批上市用于進(jìn)展期HCC患者治療,這些藥物的作用機(jī)制類似,都是作用于VEGFR、PDGFR以及Raf等受體酪氨酸蛋白激酶蛋白以及下游MAPK等信號(hào)通路最終抑制HCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲以及腫瘤血管生成作用[10]。其他藥物,包括曲妥珠單抗等都沒能通過臨床試驗(yàn)。研究和開發(fā)新的治療和干預(yù)靶標(biāo)成為現(xiàn)階段亟需解決的問題。

本研究闡明了miR-30a-3p/OCT-1在HCC中的作用,發(fā)現(xiàn)在HCC細(xì)胞中過表達(dá)miR-30a-3p具有良好的抗腫瘤作用。作為重要的腫瘤促進(jìn)因子,OCT-1能夠作為轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)多種下游基因的轉(zhuǎn)錄,這些因子主要是細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)因子,也包括部分耐藥相關(guān)因子。這使得OCT-1是HCC治療的理想干預(yù)靶點(diǎn):抑制OCT-1的活性或下調(diào)其表達(dá)水平既能夠直接抑制HCC的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲作用,同時(shí)也能夠促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)其他抗腫瘤藥物的敏感性。

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