周 超 馬銀鵬 包旭翔 李春君 張介馳,2*

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000）

黑木耳（Auricularia heimuer）又稱光耳、云耳等[1]，隸屬于擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[2]。黑木耳食藥兼用，具有高營養(yǎng)價值，含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，以及多糖、黑色素、多酚、黃酮等活性物質(zhì)[3]和人體必需的7 種氨基酸[4]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2020 年全國黑木耳產(chǎn)量再創(chuàng)新高，達到706.43 萬噸，在食用菌產(chǎn)業(yè)中名列前茅[5]。

20 世紀40 年代二戰(zhàn)期間，由于抗生素生產(chǎn)的需要，產(chǎn)生了液體深層發(fā)酵技術(shù)，美國弗吉尼亞大學(xué)Elmer.L.及Gaden.Jr 設(shè)計出了培養(yǎng)微生物的生物反應(yīng)器。1948 年Humfeld[6]用液體發(fā)酵法成功培養(yǎng)出蘑菇菌絲體，此后，食用菌液體發(fā)酵技術(shù)得到進一步應(yīng)用，并帶動了多個食用菌品種的發(fā)酵技術(shù)研究。尤其對于部分無法人工栽培獲得子實體的食用菌品種，液體深層發(fā)酵是大量獲取菌絲體的重要方法，獲得更多高品質(zhì)的菌絲體已經(jīng)成為發(fā)酵技術(shù)研究的主攻方向。然而，作為食用菌產(chǎn)業(yè)中的重要種類，黑木耳有關(guān)液體發(fā)酵技術(shù)的研究并不多，發(fā)酵技術(shù)強化研究主要聚焦于富集培養(yǎng)菌絲體和獲得發(fā)酵活性物質(zhì)。近年來，隨著黑木耳菌包工廠化生產(chǎn)規(guī)模的擴大，黑木耳液體菌種需求量顯著增加，推動了基于提升液體菌種生產(chǎn)能力和產(chǎn)品品質(zhì)的研究工作。本文對黑木耳液體發(fā)酵的研究應(yīng)用進展進行綜述分析，以期為擴大黑木耳液體發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用領(lǐng)域和生產(chǎn)規(guī)模提供參考。

1 黑木耳液體發(fā)酵主要研究方向

黑木耳可以通過人工栽培獲得充足的子實體，因此其液體發(fā)酵研究和應(yīng)用相較于其他無法人工栽培的食用菌品種并不活躍。但隨著近年來黑木耳菌包工廠化生產(chǎn)規(guī)模的迅速擴大，液體菌種被大量使用，其液體發(fā)酵研究正在逐漸成為新的熱點。為了得到更多高活力的菌絲體，黑木耳液體發(fā)酵研究主要關(guān)注于營養(yǎng)基質(zhì)優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化和外源物質(zhì)影響方面，也有關(guān)于發(fā)酵活性產(chǎn)物的提取及液體飲品開發(fā)的研究。

1.1 營養(yǎng)基質(zhì)優(yōu)化研究

營養(yǎng)基質(zhì)優(yōu)化包括最佳原料篩選和基質(zhì)配方優(yōu)化。在原料篩選方面，以液體發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲生物量為評價指標，開展了大量的單因素比較試驗。如張恒銀等[7]研究發(fā)現(xiàn)最適碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母膏；荊瑞勇等[8]研究發(fā)現(xiàn)最適碳源和氮源為蔗糖和豆粉；矯天育[9]研究發(fā)現(xiàn)最適碳源是紅糖，最適氮源是蛋白胨、酵母膏。也有研究表明最適碳氮源為一些農(nóng)產(chǎn)品，如王慶武等[10]研究顯示碳源以玉米粉、淀粉為佳，氮源以酵母膏、麩皮為佳；王旭等[11]研究顯示最適碳氮源為黃豆粉和麥麩。綜上可見，當碳源為葡萄糖、蔗糖、紅糖、黃豆粉、玉米粉等，氮源為酵母膏、麩皮、豆粉、蛋白胨時，黑木耳液體發(fā)酵菌絲生物量較高。雖然不同實驗得出的最適碳氮源存在差異，但以上研究均認為有機碳氮源優(yōu)于無機碳氮源。且上述實驗配方中均有添加少量微量元素，可見微量元素也是不可或缺的。

在確定最適原料的基礎(chǔ)上，有多項基質(zhì)配方優(yōu)化研究報道。李超等[12]和于海洋等[13]通過正交試驗優(yōu)化，分別得到最佳配方為葡萄糖2.00%、酵母膏1.00%、KH2PO40.30%、MgSO4·7H2O 0.15%和葡萄糖3.00%、酵母浸膏0.20%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.10%。錢雪婷等[14]和解修超等[15]則通過響應(yīng)面法優(yōu)化配方，分別得到最佳配方為葡萄糖2.16%、牛肉粉0.48%、KH2PO40.33 %、MgSO4·7H2O 0.10%和葡萄糖5.027%、蛋白胨0.45%、麥麩1.50%、MgSO4·7H2O 0.10%、KH2PO40.493%。綜合分析以上基質(zhì)優(yōu)化配方，其碳氮源濃度基本一致，碳源濃度范圍為2.00%～5.00%，氮源濃度范圍為0.20%～1.00%。針對不同試驗中最適碳氮源及濃度有所不同的情況，分析其原因可能與試驗菌種特性有關(guān)，不同菌種的菌絲利用碳氮源速度不同，而原料的不同理化性質(zhì)也會對發(fā)酵培養(yǎng)基性狀造成影響。

1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化研究

液體發(fā)酵生產(chǎn)受環(huán)境條件影響較大，適宜的發(fā)酵條件能使黑木耳菌絲迅速生長而縮短生產(chǎn)周期。然而，發(fā)酵條件優(yōu)化研究結(jié)果顯示差異較大。孟麗君等[16]研究認為溫度對菌絲生物量影響最大，其次為接種量、搖瓶轉(zhuǎn)速、裝液量。王謙等[17]報道初始pH 對菌絲生物量影響最大，其次為搖瓶轉(zhuǎn)速、接種量，而溫度對菌絲生物量影響則最小，該研究還發(fā)現(xiàn)當轉(zhuǎn)速過高時會形成很大的剪切力，雖然提高了溶氧量，但菌絲體遭到破壞，影響了菌絲體的正常生長和代謝。眾多研究結(jié)果顯示，液體發(fā)酵最適溫度在25～30 ℃之間，該溫度范圍與黑木耳菌絲固體培養(yǎng)一致。

此外，不同研究結(jié)果顯示的最優(yōu)裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間和初始pH 均有差異，如李玉梅等[18]和錢雪婷[19]的研究結(jié)果表明，最佳裝液量分別為65 mL 和100 mL（均為250 mL 錐形瓶），最適pH 分別為5.0 和5.85；車星星等[20]和盛立柱等[21]的試驗結(jié)果顯示最佳培養(yǎng)時間分別為7 天和6 天。造成最優(yōu)發(fā)酵條件差異較大的原因可能是由于試驗菌株本身特性差異和培養(yǎng)基質(zhì)特性差異。目前研究大都是利用搖瓶分批發(fā)酵，對規(guī)?；l(fā)酵罐通氣培養(yǎng)的指導(dǎo)作用有限。張介馳等[22]利用20 L 發(fā)酵罐進行通氣培養(yǎng)，跟蹤發(fā)酵過程中多項指標的變化規(guī)律，并通過加大通氣量、提高溶氧濃度的調(diào)控手段，有效抑制了發(fā)酵液中期pH 下降，該試驗結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中，針對發(fā)酵醪變化采取相關(guān)調(diào)控措施，可以提高液體發(fā)酵水平。

1.3 外源物質(zhì)影響研究

除營養(yǎng)及發(fā)酵條件外，外源添加物質(zhì)也會影響菌絲生物量，甚至在延緩液體菌種老化的問題上也有獨特意義。根據(jù)張穎等[23]研究結(jié)果，刺五加水提液可明顯提高黑木耳菌絲生物量，添加量在1%時菌絲生物量達到最大。潘琴等[24]報道不同濃度的麻櫟木醋液對黑木耳菌絲生物量均起抑制作用，隨著麻櫟木醋液濃度的增加，菌絲生物量會出現(xiàn)不同程度的減少。說明不同外源添加物質(zhì)會對菌絲生物量造成不同的影響。作為菌種使用的黑木耳液體發(fā)酵，不僅要菌絲生產(chǎn)效率高，同時也需要有較好的生物活性。許修宏等[25]研究不同營養(yǎng)物質(zhì)對黑木耳液體菌種老化的影響發(fā)現(xiàn)，KH2PO4和維生素B1均能在延緩菌絲老化的同時促進菌絲生長，MgSO4能延緩菌絲老化但抑制菌絲生長，而過量蛋白胨會促進菌絲的老化及生長。該研究還發(fā)現(xiàn)，清除活性氧自由基相關(guān)酶的活性與菌絲老化具有顯著相關(guān)性，酶活性的提高能延緩菌絲老化。液體菌種老化是困擾多年的問題，該實驗結(jié)果為延緩菌種老化指明了新的研究方向。

1.4 獲取特定發(fā)酵產(chǎn)物研究

除了用于生產(chǎn)液體菌種，獲取特定的發(fā)酵產(chǎn)物也是開展黑木耳液體發(fā)酵研究的重要目的。黑木耳中含有多糖、黑色素、多肽、多酚、黃酮等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化性[26]、抗腫瘤[27]、抑菌抗病毒[28]、抗輻射[29]、提高免疫力[30]、改善肝損傷[31]、降血脂[32]等多種功效。從黑木耳子實體中提取活性物質(zhì)是目前的主要途徑，然而與之相比，從黑木耳液體發(fā)酵菌絲體及發(fā)酵液中提取活性物質(zhì)具有自動化控制、規(guī)?；a(chǎn)、成本低、速度快等優(yōu)點。在這一方面，研究人員同樣關(guān)注于對液體發(fā)酵技術(shù)進行營養(yǎng)、條件優(yōu)化，但相比于制備液體菌種主要關(guān)注菌絲生物量及活力，液體發(fā)酵獲取發(fā)酵產(chǎn)物則更注重于通過誘導(dǎo)或優(yōu)化等手段提高黑色素、多糖等活性物質(zhì)含量。

研究表明，活性物質(zhì)的產(chǎn)量高低不僅與液體發(fā)酵時的營養(yǎng)條件有關(guān)，而且與所使用的菌株有關(guān)。李洋等[33]通過單因素及響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到黑木耳液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳基質(zhì)配方為：可溶性淀粉3%、胰蛋白胨0.15%、莎白瓜皮4%、紅景天10%，此配方下胞外多糖含量為0.024 51 g/mL。范秀芝等[34]以菌絲生物量和多糖產(chǎn)量為指標從22 個國家審定黑木耳品種中篩選出黑木耳2 號（國家審定編號：2007018）高產(chǎn)多糖菌株，其多糖含量達到1.239 g/L，是其他菌株的2 倍以上。

大量研究表明，活性物質(zhì)含量也受外源物質(zhì)影響。如，Sun 等[35]研究發(fā)現(xiàn)酵母提取物、乳糖和酪氨酸對黑色素合成有顯著影響，并首次證實酪氨酸能促進黑色素的合成。為提高黑色素濃度，該研究還對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，與未優(yōu)化的培養(yǎng)基相比，黑色素濃度提高了2.14 倍，達到2.97 g/L，同時還降低了成本。Wu 等[36]研究發(fā)現(xiàn)：1%甲醇、0.25%花生油、1.0%硬脂酸、0.5%棕櫚酸均能促進黑色素的合成，而Tween 80 則顯著抑制黑色素的合成。許哲祥等[37]發(fā)現(xiàn)刺五加、五味子兩種中草藥的添加量分別為4 g/L、3 g/L 時，能顯著促進發(fā)酵液中多糖含量的提高。

綜上所述，黑木耳液體發(fā)酵活性物質(zhì)的產(chǎn)量受到營養(yǎng)物質(zhì)、環(huán)境條件、菌株自身特性等多種因素的共同影響，關(guān)于哪種因素對某種活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響最大等問題，目前仍缺乏相應(yīng)的研究。

1.5 黑木耳發(fā)酵飲料研究

黑木耳液體發(fā)酵能實現(xiàn)對硒、鐵、鋅、碘等微量元素進行富集，可以開發(fā)成富含微量元素的飲料、口服液、食品等，有利于人們在日常生活中攝入每天所必需的微量元素，避免因缺乏微量元素而導(dǎo)致的疾病，擁有健康的身體。目前黑木耳飲料多數(shù)仍由黑木耳子實體制備[38-41]，采用發(fā)酵液制作飲料雖起步較晚但也取得了一定的進展。使用液體發(fā)酵制作飲料時在添加營養(yǎng)源及外源物質(zhì)時不僅要考慮菌絲及發(fā)酵液營養(yǎng)成分，更需要考慮發(fā)酵液的口感及安全性。

靳發(fā)彬等[42]將黑木耳液體發(fā)酵菌絲體經(jīng)破壁勻漿處理后與蘋果汁按照一定比例混合均勻，研究木耳果醋的發(fā)酵工藝參數(shù)和口味調(diào)配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒精發(fā)酵的最適條件為溫度30 ℃，酵母接種量0.02%，發(fā)酵時間5 天；醋酸發(fā)酵的最適條件為溫度35 ℃，接種量10%，起始pH 5.5。此條件下生產(chǎn)的發(fā)酵液，與蘋果汁、蜂蜜調(diào)配后生產(chǎn)的成品黑木耳醋酸飲料同時具有醋酸飲料特有的風(fēng)味和黑木耳的獨特營養(yǎng)和藥理作用。黃賢剛[43]以黑木耳發(fā)酵液和濃縮蘋果汁為主要原料，通過正交實驗和響應(yīng)面試驗對黑木耳液體深層發(fā)酵、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵的工藝進行了研究與優(yōu)化，得到黑木耳蘋果醋產(chǎn)品的最佳配方為黑木耳蘋果醋10%、濃縮蘋果汁40%、蔗糖10%。此配方下黑木耳蘋果醋色澤金黃，澄清透明，清香醇郁，酸甜可口，口感柔和，同時具有醋香及果香。李穎躍等[44]通過正交試驗優(yōu)化配方開發(fā)黑木耳茶菌飲料，結(jié)果以配方紅茶菌液25%、黑木耳發(fā)酵液40%、白砂糖8%、CMC（羧甲基纖維素）0.15%最佳，生產(chǎn)的該飲料色澤橘黃，風(fēng)味獨特，口感細膩，同時兼有黑木耳和紅茶菌液的營養(yǎng)及保健價值。

除以上研究外，黑木耳發(fā)酵液也被應(yīng)用于藥物開發(fā)領(lǐng)域。其中，郝敏等[45]以黑木耳液體發(fā)酵液中的產(chǎn)物為材料進行研究的結(jié)果表明，黑木耳胞外多糖具有促進小鼠腸道有益菌群增殖、增加短鏈脂肪酸含量及上調(diào)血清抗炎因子水平的作用，對調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和免疫反應(yīng)有重要作用，具有替代抗生素的潛在價值。竇會娟等[46]通過實驗證明黑木耳發(fā)酵液提取產(chǎn)物具有群體感應(yīng)抑制作用，但不能抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。目前雖然液體發(fā)酵制作飲料、藥物等已經(jīng)取得一定的研究進展，但仍有化妝品、膳食補充劑等較多領(lǐng)域等待探索。

2 黑木耳液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用

黑木耳液體菌種研究報道最早在1983 年，萬國昌等[47]對黑木耳、香菇等六種食用菌液體菌種進行初步探究，結(jié)果表明液體菌種具有周期短、成本低等優(yōu)點，同時發(fā)現(xiàn)液體粘度與菌絲體數(shù)量成正相關(guān)，與菌絲體大小呈負相關(guān)。與固體菌種相比，液體菌種用于黑木耳栽培具有明顯的優(yōu)勢。1989—2022 年期間，陳惠群[48]、劉永昶[49]、王玲[50]、葉曉菊[51]、馮偉林[52]等諸多科研工作者研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳液體菌種接種后萌發(fā)快、生長點多，接種后的原種和栽培種培養(yǎng)周期縮短、基內(nèi)菌絲菌齡一致性好、栽培出耳表現(xiàn)好。趙厚坤等[53]研究發(fā)現(xiàn)液體菌種接種的菌包滿袋時間比固體菌種的縮短10～15 天，平均每袋產(chǎn)量提高10 g左右。據(jù)王慶武等[54]研究結(jié)果，黑木耳液體菌種比木屑和枝條菌種的制種周期分別縮短34 天和31 天，滿袋時間分別縮短18 天和15 天。使用黑木耳液體菌種有利于縮短生產(chǎn)周期和提高生產(chǎn)效率，從而實現(xiàn)黑木耳菌包工廠化、規(guī)?；a(chǎn)。

黑木耳液體發(fā)酵技術(shù)主要應(yīng)用于黑木耳菌包生產(chǎn)企業(yè)的液體菌種生產(chǎn)。據(jù)黑龍江省食用菌協(xié)同創(chuàng)新推廣體系統(tǒng)計，2021 年在黑木耳主產(chǎn)區(qū)黑龍江省，日產(chǎn)萬袋以上的規(guī)模化黑木耳菌包生產(chǎn)企業(yè)超過300家，其中22 家日生產(chǎn)能力超過10 萬袋的企業(yè)都在使用黑木耳液體菌種，大部分新建小型菌包生產(chǎn)企業(yè)也在使用液體菌種。黑木耳液體菌種生產(chǎn)一般采用800～1 000 L 通氣發(fā)酵罐，絕大部分行分批發(fā)酵、極少使用連續(xù)發(fā)酵。其他黑木耳產(chǎn)區(qū)的大型菌包生產(chǎn)企業(yè)也在使用黑木耳液體種，生產(chǎn)應(yīng)用日趨穩(wěn)定成熟。據(jù)此估計，全國全年黑木耳液體菌種生產(chǎn)量可達60 000 m3，應(yīng)用生產(chǎn)黑木耳菌包約30 億袋。

由于我國黑木耳產(chǎn)量大、分布廣，不同產(chǎn)地、季節(jié)和栽培模式生產(chǎn)的黑木耳產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，部分黑木耳子實體被用來提取多糖、蛋白等功效物質(zhì)，或者粉碎后制備顆粒飲料和沖劑，這在一定程度上限制了黑木耳液體發(fā)酵醪液中菌絲體和代謝產(chǎn)物應(yīng)用于產(chǎn)品。目前，很多黑木耳液體發(fā)酵生產(chǎn)制備菌絲體、提取代謝產(chǎn)物和綜合利用發(fā)酵醪液的技術(shù)成果還停留在中試水平，少見大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

3 展望

液體發(fā)酵技術(shù)發(fā)展距今雖不到百年歷史，但隨著社會與科技的快速發(fā)展進步，液體發(fā)酵技術(shù)得以飛速發(fā)展和日趨完善，逐漸應(yīng)用于多個領(lǐng)域。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)整體的提升，黑木耳也受到較大關(guān)注，關(guān)于黑木耳液體發(fā)酵的研究也逐漸深入寬泛，取得了較多突破性的進展，但也存在生產(chǎn)應(yīng)用中迫切需要解決的問題。黑木耳液體發(fā)酵制備液體菌種的研究目前大多數(shù)以搖瓶實驗為主，基于發(fā)酵罐生物反應(yīng)器的研究偏少，還鮮見對通氣條件下的深層發(fā)酵開展深入研究，導(dǎo)致在生產(chǎn)規(guī)模放大時出現(xiàn)較大偏差。搖瓶試驗結(jié)果在影響傾向上可以提供有益借鑒，但還需要開展通氣發(fā)酵條件的優(yōu)化和實踐應(yīng)用檢驗。與此同時，黑木耳液體發(fā)酵醪液作為菌種應(yīng)用的活性質(zhì)量等評價指標還不夠完善和準確，需要強化其與接種應(yīng)用后實際生產(chǎn)效果的有效關(guān)聯(lián)，并在此基礎(chǔ)上建立實用的評價體系和簡便的檢測方法。

與固體基質(zhì)栽培生產(chǎn)黑木耳子實體相比，液體發(fā)酵黑木耳在特定領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢。隨著工業(yè)化信息化進程加速，黑木耳液體發(fā)酵的生產(chǎn)能力、生產(chǎn)效率和生產(chǎn)可控性必將逐步增強，在營養(yǎng)物質(zhì)和功效物質(zhì)生產(chǎn)提取方面具有巨大的潛在生產(chǎn)能力和發(fā)展空間。因此，有必要加強固體栽培和液體發(fā)酵生產(chǎn)黑木耳產(chǎn)品之間差異特性的比較研究，探索差異形成的生理機制，為更好地規(guī)?；瘧?yīng)用黑木耳液體發(fā)酵技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。