黃瑩潔 劉 鑫 黃 成 史雪姣 趙倩楠 田 源 代 龍 張加余 滿玉清 王少平

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003； 2 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院 上海 200240

土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲中華冀土鱉和地鱉等干燥雌蟲體，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列中品，具活血逐瘀、破血消癥之效。中醫(yī)臨床多將其用于跌打損傷，筋傷骨折，血瘀經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻腹痛，癮瘕痞塊等病證的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，土鱉蟲單味藥材及其復(fù)方制劑對(duì)高脂血癥、高血壓、血管性炎癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病具有明確的效果，且副作用小于臨床常用西藥。因此，對(duì)土鱉蟲的需求量日益增加[1-5]。

目前土鱉蟲常用炮制品為其干品，且這一飲片規(guī)格被收載于歷版《中國(guó)藥典》和多個(gè)地方中藥材炮制規(guī)范內(nèi)。本研究前期對(duì)土鱉蟲烘干的炮制方法進(jìn)行本草考證，發(fā)現(xiàn)此炮制方法最早出現(xiàn)于漢代，經(jīng)唐宋兩代沿革至清朝時(shí)逐步規(guī)范化?！度珖?guó)中藥材炮制規(guī)范》1988年版規(guī)定：“土鱉蟲，或曬干、瀝干，或置炒鍋內(nèi)，炒制干燥，即得”。目前，干土鱉蟲已成為中藥材市場(chǎng)內(nèi)主要的飲片?！逗笔≈兴幉呐谥埔?guī)范》2009年版明確了甘草制土鱉蟲的炮制方法和臨床應(yīng)用，對(duì)兩種土鱉蟲炮制飲品的功效進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者并無(wú)區(qū)別[6-12]。

動(dòng)物類中藥是中藥的重要組成部分。作為血肉有情之品，其藥效較植物藥更加明確高效。動(dòng)物類中藥的主要成分為蛋白質(zhì)，其次為脂質(zhì)類成分。研究者圍繞其蛋白質(zhì)的組成、功能和藥效進(jìn)行了大量工作，并取得了一系列成果，例如水蛭中的水蛭素、地龍中的纖溶酶和蛇毒蛋白的發(fā)現(xiàn)。但動(dòng)物類中藥常具有一定的偏性，需經(jīng)過(guò)凈制、炒制和酒制等不同炮制處理后方可用于臨床。炮制方法的不同會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物類中藥蛋白質(zhì)的變性，但不會(huì)造成其含量的增減。而脂質(zhì)類成分，例如油酸、亞油酸和甘油磷酯類成分可受高溫影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。甘草的調(diào)和諸藥之特性，加之其所含的皂苷成分表面活性劑的特點(diǎn)在炮制藥材中可能造成其脂質(zhì)成分的丟失。由此推測(cè)，干土鱉蟲和甘草制土鱉蟲的脂質(zhì)成分可能存在一定差異，但具體的成分差異性目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

脂質(zhì)組學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為載體，從整體性、規(guī)模性和科學(xué)性上對(duì)全部脂質(zhì)進(jìn)行測(cè)定的一門新興技術(shù)，其整體性的研究方法可彌補(bǔ)傳統(tǒng)氣相質(zhì)譜所表現(xiàn)的單一性、穩(wěn)定性差和低重復(fù)性的不足，目前已被廣泛應(yīng)用于疾病機(jī)制新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、藥物作用靶點(diǎn)修正和動(dòng)植物脂質(zhì)積累差異等研究[13-15]。本研究運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)，輔以整體數(shù)據(jù)分析方法對(duì)干土鱉蟲和甘草制土鱉蟲的脂質(zhì)差異進(jìn)行系統(tǒng)分析，明晰兩種土鱉蟲炮制品中的脂質(zhì)差異，為后期土鱉蟲的全物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 土鱉蟲(產(chǎn)自山東省長(zhǎng)清區(qū)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院代龍教授鑒定為鱉蠊科昆蟲中華冀土鱉的干燥雌蟲體)，甘草(產(chǎn)自河北省安國(guó)縣，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院代龍教授鑒定為光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根)；石油醚(沸程60～90℃，批號(hào)為20201021，購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(批號(hào)為2020年5月5日)，異丙醇(批號(hào)為20201208)，乙腈(批號(hào)為20200403)，以上均為分析級(jí)，購(gòu)自于天津富宇化學(xué)試劑有限公司；去離子水(批號(hào)為20210307，杭州娃哈哈純凈水有限公司)。1.5 mL EP管，10 cm玻璃棒，1、2.5 mL一次性注射器，0.5、2 mL液相小瓶，500 mL圓底燒瓶，100、500 mL量筒，100 μL、1mL一次性槍頭。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 KQ-500V型超聲波清洗器(500 Hz，購(gòu)自于昆山市超聲儀器有限公司)，KDM型調(diào)溫電熱套(2000 W)， SCIEX Exion LC聯(lián)合5600 Q-TOF mass spectrometer (AB Sciex，F(xiàn)oster City，CA，USA)液質(zhì)聯(lián)用儀，球形冷凝管，電磁爐，圓底燒瓶。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘草制土鱉蟲的制備 取甘草30 g，置于鐵鍋內(nèi)，加水300 mL，煎煮30 min，趁熱濾過(guò)，保留初濾液；殘?jiān)偌铀?50 mL，煎煮15 min，過(guò)濾后將兩次濾液合并，減壓濃縮至150 mL備用。取干土鱉蟲500 g，置于甘草水內(nèi)，浸潤(rùn)30 min至潤(rùn)透，后依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版“清炒法”項(xiàng)下操作方法進(jìn)行操作，放涼，即得甘草制土鱉蟲飲片。

1.3.2 脂質(zhì)樣品的制備 取干土鱉蟲和甘草制土鱉蟲適量，各6份，粉碎，過(guò)100目篩，粉末分別置于500 mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，再加入500 mL石油醚，置于電熱套內(nèi)，采用回流提取方法對(duì)土鱉蟲兩種炮制品的總脂質(zhì)進(jìn)行提??；提取時(shí)間設(shè)置為2.0 h，分別過(guò)濾，收集濾液；再加入相同體積的石油醚重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，分別將兩種土鱉蟲炮制品的石油醚提取液進(jìn)行合并，減壓回收(-0.080～-0.10 mPa，40℃)石油醚，制得干土鱉蟲總脂肪油和甘草制土鱉蟲總脂肪油。

取以上兩種土鱉蟲炮制品總脂肪油各200 μL，置于1.5 mL EP管中， 13 000 r/min離心10 min，取上清液。吸取20 μL上清液于1.5 mL EP管中，加入180 μL異丙醇-乙腈(90∶10)稀釋10倍，渦旋10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清溶液100 μL于進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)插管，分別標(biāo)記為C1～C6，GC1～GC-6。

1.4 數(shù)據(jù)采集

1.4.1 液相條件 色譜柱為Waters Acquity BEH C18 column(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為1 μL，柱溫為55℃。流動(dòng)相A為水—乙腈(40∶60，含0.1%甲酸與5 mM甲酸銨)；流動(dòng)相B為異丙醇—乙腈(90∶10，含0.1%甲酸與5 mM甲酸銨)，采用梯度洗脫方法，梯度設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫順序設(shè)置

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正負(fù)離子采集模式，其中漂移管溫度為550℃，噴霧電壓為55 kv，毛細(xì)管電壓為-55 kv，鞘氣流速為55 psi，輔助氣流速為55 psi，掃描范圍為150～1 050 m/z，分辨率分別為70 000(一級(jí))和30 000(二級(jí))，歸一化能量為40%。

2 結(jié)果

2.1 差異脂質(zhì)成分篩選 采用設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件對(duì)樣品進(jìn)行分析，通過(guò)其質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下，兩種脂質(zhì)樣品分離尚可(圖1)。其中干土鱉蟲內(nèi)鑒定出85種脂質(zhì)成分，包括甘油脂(GL)37個(gè)，脂肪酸(FA)37個(gè)，甘油磷脂(GP)10個(gè)，固醇脂(ST)1個(gè)。將其數(shù)據(jù)對(duì)齊后導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，篩選差異物質(zhì)。其中PCA得分圖揭示在正負(fù)離子模式下，土鱉蟲干品和甘草制土鱉蟲的脂質(zhì)樣品組完全分開，其中正離子模式下R2X 0.824，Q2 0.742，而負(fù)離子模式下R2X 0.757，Q2 0.537，說(shuō)明模型擬合良好(圖2)。

圖1 干土鱉蟲和甘草制土鱉蟲的BPC圖

a. 正離子模式下的PCA分析；b. 負(fù)離子模式下的PCA分析。

在OPLS-DA分析中，干土鱉蟲和甘草制土鱉蟲的脂質(zhì)樣本也完成分開，同時(shí)采用以下條件進(jìn)行差異性變量篩選：VIP大于1.0；t檢驗(yàn)，P<0.05；S-plot中P>0.05且Pcorr>0.3。共篩選出差異脂質(zhì)成分68個(gè)(圖3)。

a. 正離子模式下的OPLS-DA分析；b. 負(fù)離子模式下的OPLS-DA分析；c. 正離子模式下的S-plot分析結(jié)果；d. 負(fù)離子模式下的S-plot分析結(jié)果。

2.2 差異脂質(zhì)成分分析 將兩種土鱉蟲炮制品的差異脂質(zhì)成分的精確相對(duì)分子質(zhì)量m/z、相對(duì)保留時(shí)間tR進(jìn)行整理，并運(yùn)用HMDB和Metlin等代謝物鑒別數(shù)據(jù)庫(kù)，輔以Pubchem和chemspider等化合物公開數(shù)據(jù)庫(kù)，并根據(jù)二級(jí)裂解碎片離子碎片信息，對(duì)化合物進(jìn)行鑒別，最終發(fā)現(xiàn)：兩種土鱉蟲炮制品脂質(zhì)差異成分主要分為4類，分別為甘油脂類(32個(gè))，脂肪酸類(26個(gè))，甘油磷脂類(9個(gè))，固醇脂類(1個(gè))(表2)。

根據(jù)差異脂質(zhì)成分在Q OTF中的響應(yīng)值，并利用SCIEX OS-Analyst軟件收集干土鱉蟲差異脂質(zhì)成分的保留時(shí)間tR)和峰面積(A)，建立tR-A的數(shù)據(jù)矩陣。以干土鱉蟲飲片中的差異脂質(zhì)成分的色譜信息為基準(zhǔn)，計(jì)算甘草制土鱉蟲差異脂質(zhì)成分的峰面積差異率(%)，公式為：

式中A1為tR下的甘草制土鱉蟲差異脂質(zhì)成分峰面積，A為tR干土鱉蟲差異脂質(zhì)成分峰面積。

由以上公式結(jié)合差異脂質(zhì)成分信息得出，兩種土鱉蟲炮制品中多種脂質(zhì)成分的相對(duì)含量存在差異。其中，土鱉蟲與甘草制土鱉蟲差異脂質(zhì)比較，甘草制后甘油二酯類低于炮制前，其余均高于炮前(圖4)。這說(shuō)明，土鱉蟲油脂在經(jīng)甘草炮制后含量明顯減少。

表2 兩種土鱉蟲炮制品的差異脂質(zhì)成分

圖4 土鱉蟲炮制前后各類脂質(zhì)成分相對(duì)含量變化結(jié)果

3 討論

炮制工藝是中藥在進(jìn)入臨床前最重要的藥物處理技術(shù)，目前已逐步發(fā)展為一門學(xué)科。中醫(yī)醫(yī)家古籍對(duì)中藥炮制技術(shù)和方法具有嚴(yán)格的考證，同時(shí)也對(duì)藥物炮制前后的藥性變化進(jìn)行了分析。本研究前期對(duì)土鱉蟲的炮制方法進(jìn)行充分考證，得出土鱉蟲自古以來(lái)的炮制方法有熬、炒、焙、烘、油炸、油焙和甘草伴炙等?，F(xiàn)代最常用的土鱉蟲炮制方法則為炒法和甘草水制法。本研究以目前市場(chǎng)常見(jiàn)的炒土鱉蟲和甘草水制土鱉蟲為材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

中醫(yī)認(rèn)為，動(dòng)物類中藥均存在部分偏性或毒性，例如土鱉蟲的小毒特性，蠶蛹和美洲大蠊的滑腸偏性[16-18]。脂質(zhì)是動(dòng)物類中藥中除蛋白質(zhì)以外的第二大類成分，且脂質(zhì)可能是造成動(dòng)物類中藥偏性的主要物質(zhì)。美洲大蠊油脂可引起小鼠腎臟毒性，且這一效果與美洲大蠊中的棕櫚酸含量高存在直接關(guān)系[19-20]。不同的炮制方法可能對(duì)消除或減弱動(dòng)物類中藥脂質(zhì)所造成的毒性和偏性具有顯著效果。

綜上所述，本研究采用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)干土鱉蟲和甘草制土鱉蟲中的脂質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩種炮制方法對(duì)土鱉蟲脂質(zhì)成分種類和相對(duì)含量存在明顯差異。本研究將為土鱉蟲不同炮制品的全物質(zhì)成分分析提供可借鑒的思路。