陳 鵬，郭潔梅，肖 艷，王建輝，蘇友新*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；

2 中醫(yī)骨傷及運動康復(fù)教育部重點實驗室，福建 福州 350122；

3 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）患者中約90%伴有滑膜組織炎癥表現(xiàn)，其嚴重程度與KOA 病程發(fā)展正相關(guān)［1］。KOA滑膜組織炎癥可通過加劇軟骨退化、加速膝關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成及軟骨下骨增生硬化進一步加重KOA 的病理進程［2-4］。核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）通路激活可誘導(dǎo)相關(guān)下游炎癥因子的表達以加重炎癥反應(yīng)［5］，在KOA滑膜組織炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［6］。研究表明，滑膜組織內(nèi)滑膜巨噬細胞中肝X 受體（liver X receptors，LXRs）可通過募集核受體輔助抑制因子（nuclear receptor co-repressor，N-CoR），間接抑制NF-κB 通路中P50、P65 參與的白介素-1β（Interleu?kin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子表達［7-8］，從而減輕KOA滑膜組織炎癥。壯骨健膝方是課題組根據(jù)KOA 病機特點總結(jié)的效驗方，前期已開展該方延緩軟骨退化系列研究及減輕KOA 滑膜組織炎癥的動物在體研究［9-10］。本研究擬進一步從體外兔滑膜組織培養(yǎng)觀察角度，闡明壯骨健膝方對KOA 滑膜組織炎癥的干預(yù)效應(yīng)及機制，為其臨床推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

34 只健康新西蘭大白兔（簡稱兔），雌雄各半，體質(zhì)量（2.0±0.3）kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供［許可證編號：SCXK（滬）2017-0008］，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心代購并飼養(yǎng)［許可證號：SYXK（閩）2019-0007］。

1.2 實驗藥物

壯骨健膝方（骨碎補∶杜仲∶川牛膝∶生地黃∶獨活∶雞血藤∶秦艽∶徐長卿∶?蟲=5∶3∶4∶5∶2∶5∶3.3∶3.3∶2），均購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定。按既定工藝濃縮至含生藥1 g/mL的藥液［10］。

1.3 試劑

木瓜蛋白酶（美國Sigma 公司，SLBR9817V）；烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，Z28N10Y10450 6）；兔IL-1β、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metal?loproteinase，MMP）-3、MMP-13 ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，MM-030501、MM-024001、MM-018701、MM-148601）；LXRα 多克隆抗體、P65 多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，BJ01036276、AI07086414）；N-CoR 單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司，A1819）；P50 多克隆抗體（美國Abcam 公司，ab194729）；LXRα 抑制劑5CPPSS-50（日本W(wǎng)ako 公司，WDM6507）；N-CoR 抑制劑ML-792（美國Santa Cruz Biotechnology 公司，66065）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，AE2916 3339）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（澳大利亞ExCellBio 公司，11G292）；D-Hank's 平衡鹽溶液（上海麥克林生物科技有限公司，C10878521）；增強型BCA 蛋白濃度測定試劑盒（080719191115）、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（081519191016）均購自上海碧云天生物科技研究所。

1.4 儀器

電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，YP202N）；切片機（德國LEICA 公司，RM2235）；攤片機（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，YF-7FB）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海掌動網(wǎng)絡(luò)科技有限公司，PYX-DNS）；光學(xué)顯微鏡（德國LEICA 公司，DM4000B-LED）；超純水裝置（德國MILLIPORE 公司，MILLI-Q）；低溫高速離心機（美國BECKMAN 公司，64R）；CO2培養(yǎng)箱（德國Herarus，E163302）；倒置式系統(tǒng)顯微鏡（日本Olympus，BX41）；全自動酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-TEK，ELX800）；垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司，Mini-PROTEAN Tetra）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，ChemiDoc XRS）。

2 實驗方法

2.1 兔含藥血清、空白血清的制備

采用隨機數(shù)字表法將12 只兔分為空白血清組和含藥血清組，每組6 只。根據(jù)前期研究并參照人與兔千克體質(zhì)量換算［11］，含藥血清組給予4.58 mL/（kg·d）壯骨健膝方藥液灌胃，每日分2次灌胃，空白血清組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃3 d。于末次灌胃1 h 后，行腹腔麻醉（20%烏拉坦5 mL/kg）后腹主動脈采血。靜置2 h后，離心25 min（4 ℃，2 500 r/min），水浴滅活（56 ℃，30 min），微孔濾膜（0.22 μm）過濾，分裝于無菌50 mL 離心管并封口，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物模型的制備及鑒定

將22 只兔采用隨機數(shù)字表法分為空白組和造模組，每組分別6 只和16 只。造模組采用兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法［12］造模，于造模的第1、4、7天對兔右后肢膝關(guān)節(jié)腔注入0.5 mL 2%木瓜蛋白酶水溶液?？瞻捉M同法注入0.5 mL 生理鹽水。于造模第14 天，觀察兔造模前后膝部皮溫、髕上周徑、Lequesne MG 量表評估情況［13］，并隨機選取空白組與造模組兔各3 只處死，無菌操作下切取右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織行HE 染色，以對模型進行鑒定。以造模后兔膝部皮溫明顯升高、髕上周徑明顯增大及Lequesne MG＞4分為KOA模型鑒定成功標準。

2.3 滑膜組織的采集及分組

模型鑒定成功后，將空白組剩余3 只兔及造模組剩余13 只兔無菌操作下切取右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜組織，浸入裝有無菌D-Hank's 液的無菌EP 管中保存。隨即轉(zhuǎn)移至超凈工作臺下，將無菌EP管中所有滑膜組織經(jīng)D-Hank's 液漂洗3 遍后，使用眼科手術(shù)剪仔細剔除滑膜周圍可見的脂肪組織，將滑膜組織剪碎成肉眼可見的大小約1～2 mm3小塊，收集60 小塊，隨機分為4 組，即模型組、壯骨健膝方組、LXRα 抑制劑組、N-CoR 抑制劑組，每組15 個組織塊，每孔3塊，每組5孔，置于6孔板中培養(yǎng)。同法取正常兔滑膜組織制備空白組，5孔。

2.4 滑膜組織體外培養(yǎng)、觀察與干預(yù)

將造模組滑膜小塊均勻排列置于無菌6 孔板中，視組織塊附著程度倒置1～2 h 后，沿孔壁緩緩加入適量含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，每日更換培養(yǎng)液1 次，置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察滑膜組織狀態(tài)，第3 天分別用10%空白血清、10%含藥血清、10%含藥血清＋5 μg/mL LXRα 抑制劑5CPPSS-50、10%含藥血清＋5 μg/mL N-CoR抑制劑ML-792進行干預(yù)，每2 d換液1次，置于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)，空白組給予10%空白血清培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實驗確定的干預(yù)時間為7 d，干預(yù)7 d后采集標本。

2.5 樣本處理及指標檢測

每組隨機選取6 個滑膜組織，4%多聚甲醛固定24 h 后脫水、包埋、切片以用于HE 染色觀察。剩余的組織塊采用移液槍移除培養(yǎng)液，濾紙吸干余下水分后，各組使用電子天平稱重取0.2 g 滑膜組織，放入玻璃勻漿管，加入1.8 mL PBS緩沖液，冰上研磨充分后收集勻漿液，離心10 min（4 ℃，3 000 r/min），取勻漿的上清液，冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆?，以供ELISA 檢測；其余的滑膜組織置于研缽中，加入液氮研磨成粉狀后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加入提前配制好的含有蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液∶蛋白酶抑制劑＝100∶1），冰上裂解5 min，然后離心20 min（4 ℃，12 000 r/min），收集上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，以供Western blot檢測。

2.5.1 兔滑膜組織HE 染色及評分 將包埋好的兔膝滑膜組織切片后進行HE 染色，用LEICA 光學(xué)顯微鏡拍片觀察滑膜組織形態(tài)，每個滑膜切片選取5個視野（×200），進行滑膜組織形態(tài)學(xué)評分，標準參照巫桁錁等［14］的方法，分別從4 個指標進行評分。見表1。

表1 滑膜病理學(xué)評分標準Table 1 Synovial pathology scoring criteria

2.5.2 兔膝滑膜組織中相關(guān)炎癥指標的ELISA 檢測 采用ELISA檢測兔膝滑膜組織勻漿的上清液中IL-1β、TNF-α、MMP-3 和MMP-13 的含量。具體步驟按試劑盒說明書操作，于450 nm 處檢測吸光度，根據(jù)說明書繪制標準曲線，由標準曲線公式計算細胞上清液中IL-1β、TNF-α、MMP-3 及MMP-13含量。

2.5.3 兔膝滑膜組織中相關(guān)蛋白的Western blot 檢測 采用BCA 法測定蛋白濃度，Western blot 法檢測各蛋白表達。一抗稀釋比例為LXRα（1∶300）、NCoR（1∶500）、P50（1∶500）、P65（1∶300）、β-actin（1∶8 000）；二抗稀釋比例為1∶10 000。將PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀上，滴加工作液，拍照，并記錄分析各目的蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，不符合正態(tài)分布則采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兔KOA模型鑒定

造模前后造模組兔右后肢膝關(guān)節(jié)皮溫、關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG 評分比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白組滑膜呈半透明，滑膜層較薄且滑膜細胞呈單層整齊排列。造模組滑膜出現(xiàn)滑膜增生且滑膜細胞呈多層紊亂排列、炎性細胞大量浸潤等改變。見表2和圖1。

圖1 光鏡下KOA兔膝滑膜組織病理HE染色圖（×200）Figure 1 Pathological observation of synovial tissue of KOA rabbits by HE staining under light micro?scope（×200）

表2 造模前后兔膝關(guān)節(jié)皮溫、關(guān)節(jié)周徑及Lequesne MG 得分等指標比較（±s）Table 2 Rabbit knee joint skin temperature，circumference，Lequesne MG scores and other indicators before and after modeling（±s）

表2 造模前后兔膝關(guān)節(jié)皮溫、關(guān)節(jié)周徑及Lequesne MG 得分等指標比較（±s）Table 2 Rabbit knee joint skin temperature，circumference，Lequesne MG scores and other indicators before and after modeling（±s）

注：與造模前比較，1）P＜0.05。Notes:Compared with that before modeling,1)P<0.05.

時間造模前造模后Lequesne MG評分/分0.00±0.00 6.67±1.441）n 16 16皮溫/℃33.90±0.13 37.00±0.211）關(guān)節(jié)周徑/cm 10.99±0.10 12.53±0.331）疼痛反應(yīng)/分0.00±0.00 1.67±0.491）步態(tài)/分0.00±0.00 2.08±0.671）關(guān)節(jié)活動范圍/分0.00±0.00 1.17±0.391）腫脹程度/分0.00±0.00 1.83±0.391）

3.2 5 組干預(yù)后滑膜組織HE 染色及形態(tài)學(xué)評分的變化情況

滑膜組織塊在整個培養(yǎng)及干預(yù)期間未出現(xiàn)明顯萎縮及色澤晦暗等表現(xiàn)。與空白組比較，模型組HE 染色可見滑膜內(nèi)襯層細胞增生且排列紊亂明顯、大量炎性細胞浸潤及纖維組織增生等改變，形態(tài)學(xué)評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組可見滑膜內(nèi)襯層細胞輕度增生排列紊亂、稀疏散在炎性細胞浸潤及少量纖維組織增生等改變，形態(tài)學(xué)評分顯著降低（P＜0.05）；分別與LXRα抑制劑組及N-CoR 抑制劑組比較，壯骨健膝方組病理改變形態(tài)學(xué)評分顯著降低（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 5組干預(yù)后滑膜組織形態(tài)學(xué)評分變化（±s）Table 3 Changes of synovial tissue morphology scores in five groups after intervention（±s）

表3 5組干預(yù)后滑膜組織形態(tài)學(xué)評分變化（±s）Table 3 Changes of synovial tissue morphology scores in five groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與壯骨健膝方組比較，3）P＜0.05。Notes:Compared with the blank group, 1) P<0.05; compared with the model group, 2) P<0.05; compared with the Zhuanggu Jianxi decoction group,3)P<0.05.

積分/分0.67±0.52 9.00±0.631）4.33±0.522）7.01±0.412）3）7.14±0.632）3）組別空白組模型組壯骨健膝方組LXRα抑制劑組N-CoR抑制劑組n66666

圖2 5組干預(yù)后滑膜組織HE染色圖（×200）Figure 2 HE staining of synovial tissue in five groups after intervention（×200）

3.3 5組干預(yù)后滑膜組織勻漿上清液IL-1β、TNFα、MMP-3和MMP-13含量變化

干預(yù)后與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組、LXRα 抑制劑組、N-CoR 抑制劑組上述指標含量均顯著降低（P＜0.05）；分別與LXRα 抑制劑組和N-CoR 抑制劑組比較，壯骨健膝方組上述指標含量均顯著降低（P＜0.05）。與干預(yù)前比較，干預(yù)后壯骨健膝方組IL-1β、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05）。見表4和表5。

表4 5組干預(yù)后滑膜IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（±s）Table 4 Comparison of IL-1β，TNF-α，MMP-3 and MMP-13 contents in synovial tissue of five groups after intervention（±s）

表4 5組干預(yù)后滑膜IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（±s）Table 4 Comparison of IL-1β，TNF-α，MMP-3 and MMP-13 contents in synovial tissue of five groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與壯骨健膝方組比較，3）P＜0.05。Notes:Compared with the blank group, 1) P<0.05; compared with the model group, 2) P<0.05; compared with the Zhuanggu Jianxi decoction group,3)P<0.05.

MMP-13/（μg/L）152.72±3.56 267.30±3.021）185.63±2.332）207.03±3.472）3）211.92±1.872）3）組別空白組模型組壯骨健膝方組LXRα 抑制劑組N-CoR 抑制劑組n33333 IL-1β/（ng/L）23.06±2.10 46.86±1.801）30.16±0.422）37.91±0.822）3）39.82±0.582）3）TNF-α/（pg/mL）112.58±7.67 348.98±5.541）187.46±10.442）248.07±8.532）3）242.53±7.562）3）MMP-3/（μg/L）20.03±0.63 31.58±1.181）20.09±1.762）26.51±0.742）3）26.95±0.032）3）

表5 壯骨健膝方組干預(yù)前后滑膜組織IL-1β和TNF-α含量比較（±s）Table 5 Comparison of IL-1β and TNF-α in synovial tis?sue in the Zhuanggu Jianxi decoction group be?fore and after intervention（±s）

表5 壯骨健膝方組干預(yù)前后滑膜組織IL-1β和TNF-α含量比較（±s）Table 5 Comparison of IL-1β and TNF-α in synovial tis?sue in the Zhuanggu Jianxi decoction group be?fore and after intervention（±s）

注：與干預(yù)前比較，1）P＜0.05。Notes:Compared with that before intervention,1)P＜0.05.

TNF-α/（pg/mL）349.55±3.07 187.46±10.441）時間干預(yù)前干預(yù)后n33 IL-1β/（ng/L）47.23±2.15 30.16±0.421）

3.4 5 組干預(yù)后滑膜組織LXRα、N-CoR、P50 和P65蛋白表達的變化

與空白組比較，模型組LXRα、N-CoR 蛋白表達明顯下降（P＜0.05），P50、P65蛋白表達明顯上升（P＜0.05）。與模型組比較，壯骨健膝方組LXRα、N-CoR蛋白表達顯著升高（P＜0.05），P50、P65 蛋白表達明顯下降（P＜0.05）；LXRα 抑制劑組LXRα、N-CoR 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），P50、P65 蛋白表達均顯著下降（P＜0.05）；N-CoR 抑制劑組LXRα蛋白表達顯著升高（P＜0.05），N-CoR 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），P50、P65 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。分別與LXRα抑制劑組及N-CoR抑制劑組比較，壯骨健膝方組LXRα、N-CoR 蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），P50、P65 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。見圖3和表6。

圖3 5組干預(yù)后滑膜組織蛋白電泳圖Figure 3 Protein electrophoresis of synovial tissue in five groups after intervention

表6 5組干預(yù)后滑膜組織中LXRα、N-CoR、P50及P65蛋白表達比較（±s）Table 6 Comparison of LXRα，N-CoR，P50 and P65 protein expression in synovial tissue in five groups after intervention（±s）

表6 5組干預(yù)后滑膜組織中LXRα、N-CoR、P50及P65蛋白表達比較（±s）Table 6 Comparison of LXRα，N-CoR，P50 and P65 protein expression in synovial tissue in five groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與壯骨健膝方組比較，3）P＜0.05。Notes:Compared with the blank group, 1) P<0.05; compared with the model group, 2) P<0.05; compared with the Zhuanggu Jianxi decoction group,3)P<0.05.

P65/β-actin 0.182 9±0.015 9 0.887 4±0.044 71）0.462 8±0.031 72）0.753 6±0.042 52）3）0.789 2±0.051 62）3）組別空白組模型組壯骨健膝方組LXRα抑制劑組N-CoR抑制劑組n33333 LXRα/β-actin 0.803 2±0.042 9 0.410 9±0.037 61）0.715 4±0.037 72）0.362 8±0.008 43）0.508 5±0.036 02）3）N-CoR/β-actin 0.864 1±0.053 3 0.399 7±0.020 51）0.706 9±0.028 02）0.378 6±0.048 43）0.345 4±0.015 83）P50/β-actin 0.167 5±0.012 5 0.835 5±0.080 41）0.469 6±0.021 82）0.691 0±0.034 22）3）0.717 6±0.067 82）3）

4 討 論

滑膜組織炎癥貫穿KOA 病程的各個時期［15］。KOA 滑膜組織炎癥不僅可加速膝關(guān)節(jié)的退變，還可導(dǎo)致疼痛、腫脹及僵硬等癥狀的發(fā)生及遷延。故抑制滑膜組織炎癥反應(yīng)以延緩膝關(guān)節(jié)病理改變、改善患者癥狀是目前KOA治療的重要環(huán)節(jié)之一［16］。

4.1 LXRs/NF-κB 通路對KOA 滑膜組織炎癥的調(diào)控作用

KOA 滑膜組織炎癥的病理表現(xiàn)包括滑膜內(nèi)襯層細胞增生及排列紊亂、炎性細胞浸潤及纖維組織增生等。一方面IL-1β、TNF-α等炎癥因子及MMPs可刺激滑膜組織導(dǎo)致其病理表現(xiàn)的加劇，另一方面滑膜組織炎癥反應(yīng)的加重可促使上述炎癥指標含量的進一步升高，最終形成惡性循環(huán)。研究顯示滑膜組織中滑膜細胞NF-κB 通路的活化在KOA 滑膜炎的發(fā)病過程中扮演著重要角色［17-18］。正常情況下，P65 和P50 與IκBα 以共聚體形式存在于胞質(zhì)內(nèi)，當受到外界刺激后，IκBα 發(fā)生磷酸化并降解，P65 和P50 進入細胞核，促進IL-1β、TNF-α 等炎癥因子及MMPs 的表達［19］。研究表明，滑膜巨噬細胞胞漿內(nèi)LXRα 的活化可抑制巨噬細胞中的TLR3 或TLR4 從而參與調(diào)控炎癥介質(zhì)或MMPs 的分泌，抑制機體炎癥反應(yīng)，具有較強的抗炎活性［20］。LXRα 激活后從胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核，在被SUMO 修飾的同時募集NCoR，啟動“轉(zhuǎn)錄抑制”機制，從而間接抑制NF-κB通路的活化，最終緩解機體的炎癥反應(yīng)。由此可見，LXRs/NF-κB 通路上的關(guān)鍵節(jié)點蛋白可能是調(diào)控KOA滑膜組織炎癥的有效作用靶點。

4.2 壯骨健膝方可改善KOA滑膜組織炎癥

本研究認為，“痹痿并見”是KOA 的主要特點之一，KOA 滑膜組織炎癥所致膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬等癥狀屬“痹”，行走或登梯無力、運動控制下降等癥狀屬“痿”，應(yīng)“痹痿并治”以除痹起痿［21］。壯骨健膝方經(jīng)多年臨床實踐總結(jié)而來，方中骨碎補、杜仲合用可補肝腎，強筋骨；獨活、秦艽、?蟲、雞血藤四藥合用，可祛風(fēng)除濕，舒筋止痛，祛瘀生新；徐長卿、川牛膝合用，則有強化補肝腎、祛風(fēng)濕的效果；生地黃清熱滋陰，養(yǎng)血活血，全方共奏補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之功效，痹痿同治。本課題組臨床研究證實，該方可改善KOA 患者膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及行走無力等“痹”“痿”癥狀［22］，據(jù)此圍繞“痹痿”，基于壯骨健膝方的療效及機制開展了系列基礎(chǔ)研究。體外研究發(fā)現(xiàn)，該方可能通過延緩軟骨細胞退變而發(fā)揮治痿的作用［9］；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，該方可顯著改善KOA 滑膜組織炎癥模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥細胞浸潤及纖維組織生成等病理表現(xiàn)，降低組織形態(tài)學(xué)評分而治痹［10］，但治痹作用的具體機制尚不明確。

4.3 壯骨健膝方對兔KOA 滑膜組織炎癥LXRs/NF-κB通路的影響

本研究結(jié)果表明，模型組滑膜組織在炎性反應(yīng)的刺激性下出現(xiàn)了顯著的滑膜細胞增殖能力升高現(xiàn)象［23］，與文獻中慢性炎性反應(yīng)下成纖維細胞被激活、細胞表型改變、增殖能力升高并具備侵襲能力的報道類似［24］?；そM織HE 染色及形態(tài)學(xué)積分顯示，壯骨健膝方可有效減輕兔KOA 滑膜組織炎癥的病理表現(xiàn)，而當LXRα、N-CoR 被抑制后則導(dǎo)致該病理表現(xiàn)加重。與空白組相比，模型組LXRα、N-CoR表達顯著下降，P50、P65 蛋白表達升高，IL-1β、TNF-α、MMP-3 及MMP-13 含量顯著升高，提示NF-κB 通路被激活。當使用含藥血清干預(yù)后，與模型組相比，壯骨健膝方組LXRα、N-CoR 蛋白表達顯著升高，P50、P65蛋白表達顯著降低，提示NF-κB通路受到抑制。當含藥血清中分別加入LXRα 及NCoR 抑制劑后，LXRα 及N-CoR 抑制劑組P50、P65蛋白表達顯著上升，導(dǎo)致下游相關(guān)炎癥指標含量顯著升高，提示NF-κB 通路被激活，也證實壯骨健膝方對NF-κB 通路的抑制作用，可能是通過上調(diào)LXRα表達、募集N-CoR而實現(xiàn)的。

綜上，本研究結(jié)果從兔滑膜組織水平證實，壯骨健膝方可有效改善兔KOA 滑膜組織炎癥的病理表現(xiàn)，其機制可能與其上調(diào)滑膜組織中滑膜細胞LXRs/NF-κB 通路LXRα、N-CoR 蛋白表達，從而下調(diào)P50、P65 蛋白，進而減少下游IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13的含量有關(guān)。然而，動物滑膜組織與人滑膜組織存在一定的組織差異性，故含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的兔滑膜組織僅能部分解釋壯骨健膝方對人KOA 滑膜組織炎癥的作用機制。因此，有必要進一步開展人滑膜組織及滑膜細胞的實驗研究以印證本次實驗的結(jié)論，從而多層次、多角度豐富該方治痹的內(nèi)涵。