丁志剛

骨關節(jié)炎是一種多發(fā)生于中老年人的炎癥性關節(jié)疾病，嚴重影響中老年人的生活質(zhì)量。骨關節(jié)炎病理變化主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨組織退化、軟骨細胞消失、軟骨下骨反應性增生和關節(jié)滑膜組織炎性反應等[1,2]。軟骨細胞是軟骨內(nèi)唯一存在的細胞成分，在維持軟骨正常功能和形態(tài)中發(fā)揮重要作用[3]。目前，骨關節(jié)炎的發(fā)病機制尚未明確。有研究表明，軟骨細胞損傷是骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要原因，降低軟骨細胞損傷對于骨關節(jié)炎的治療具有重要意義[4]。咪達唑侖是γ-氨基丁酸A受體激動劑，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等功效。研究表明，咪達唑侖可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路促進氧糖剝奪誘導的星形膠質(zhì)細胞增殖并抑制其凋亡[5]；咪達唑侖預先給藥可能通過抑制細胞炎性反應和細胞凋亡減輕小鼠腸缺血再灌注損傷[6]。miR-382-3p是一種微小RNA(miRNA)，參與調(diào)控細胞增殖、凋亡和炎性反應等生理或病理過程，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[7,8]。Lei等[9]研究顯示，白介素1β(IL-1β)的刺激可導致軟骨細胞中miR-382-3p的表達下調(diào)，上調(diào)miR-382-3p通過靶向CX43調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性反應。因此，本研究采用IL-1β誘導小鼠軟骨細胞ATDC5建立軟骨細胞損傷模型，主要探討咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達和凋亡的影響及其能否調(diào)控miR-382-3p發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠軟骨細胞株ATDC5，上海雅吉生物科技有限公司；咪達唑侖，江蘇恩華藥業(yè)有限公司；IL-1β，美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶公司；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-382-3p模擬物(mimics)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-382-3p抑制劑(anti-miR-382-3p)、抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:復蘇ATDC5細胞，加含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(常規(guī)培養(yǎng)基)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的ATDC5細胞以5.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-382-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-382-3p。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理:將ATDC5細胞和轉(zhuǎn)染后的細胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中。ATDC5細胞分為Con組、IL-1β組、IL-1β+MDZ-L組、IL-1β+MDZ-M組、IL-1β+MDZ-H組，其中Con組細胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-1β組細胞用含10 ng/ml[10]IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-1β+MDZ-L組、IL-1β+MDZ-M組、IL-1β+MDZ-H組細胞分別用含1、3、10 μmol/L[5]MDZ與10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-382-3p mimics的細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為IL-1β+miR-NC組、IL-1β+miR-382-3p組。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-382-3p的細胞用含10 μmol/L MDZ與10 ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，記為IL-1β+MDZ+anti-miR-NC組、IL-1β+MDZ+anti-miR-382-3p組。培養(yǎng)24 h后，分別收集各組細胞培養(yǎng)上清液和細胞，進行后續(xù)檢測。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 試劑盒法檢測細胞中IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達水平:將1.2.2中收集的各組細胞培養(yǎng)上清液進行檢測，3 500 r/min離心5 min，保留上清。分別參照IL-6、TNF-α和IFN-γ試劑盒說明書，檢測上清液中其含量。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡:將1.2.2中收集的各組細胞用PBS清洗2次，調(diào)整濃度為2.5×104個/ml。取1.0 ml細胞懸液，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入500 μl結合緩沖液，重懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，避光孵育10 min。加入5 μl PI，避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Western Blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達:將1.2.2中收集的各組細胞用PBS清洗2次，RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA法定量，以20 μg/孔蛋白行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。分別于Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)和GAPDH(1∶800)一抗孵育液中4℃過夜。再于山羊抗兔二抗(1∶3 000)孵育液中37℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-382-3p表達:將1.2.2中收集的各組細胞用PBS清洗2次，Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：miR-382-3p上游5’-ACACTCCAGCTGGGAATCA

TTC-3’，下游5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參U6上游5’-GGAACCUAGCGAAUAC-3’，下游5’-CGT

AAGATGCCGATACCGAC-3’。2-△△Ct法計算miR-382-3p相對于內(nèi)參U6的表達水平。

2 結果

2.1 咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達的影響 與Con組比較，IL-1β組IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均升高(P<0.05)。與L-1β組比較，IL-1β+MDZ-L組、IL-1β+MDZ-M組、IL-1β+MDZ-H組中IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均降低(P<0.05)，且3組間各檢測指標兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達的影響

2.2 咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響 與Con組比較，IL-1β組細胞凋亡率、Bax蛋白水平均升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。與L-1β組比較，IL-1β+MDZ-L組、IL-1β+MDZ-M組、IL-1β+MDZ-H組中細胞凋亡率、Bax蛋白水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且3組間各檢測指標兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

表2 咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響

2.3 咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-382-3p表達的影響 與Con組比較，IL-1β組miR-382-3p水平降低(P<0.05)。與L-1β組比較，IL-1β+MDZ-L組、IL-1β+MDZ-M組、IL-1β+MDZ-H組中miR-382-3p水平均升高(P<0.05)，且3組間miR-382-3p水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-382-3p表達的影響

2.4 過表達miR-382-3p對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達和凋亡的影響 與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-382-3p組miR-382-3p水平升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均降低(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表4，圖2。

圖2 過表達miR-382-3p對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響;A 過表達miR-382-3p對IL-1β誘導的軟骨細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響；B IL-1β誘導的過表達miR-382-3p的軟骨細胞流式凋亡圖

表4 過表達miR-382-3p對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達和凋亡的影響

2.5 敲減miR-382-3p表達逆轉(zhuǎn)咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達及凋亡的影響 與IL-1β+MDZ+anti-miR-NC組比較，IL-1β+MDZ+anti-miR-382-3p組miR-382-3p水平降低，差異有統(tǒng)計學意義

(P<0.05)，IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白水平均升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 敲減miR-382-3p逆轉(zhuǎn)咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的作用;A 敲減miR-382-3p逆轉(zhuǎn)咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響；B 咪達唑侖干預的IL-1β誘導的敲減miR-382-3p的軟骨細胞流式凋亡圖

表5 敲減miR-382-3p逆轉(zhuǎn)咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達和凋亡的影響

3 討論

作為機體中骨關節(jié)軟骨中的唯一細胞，軟骨細胞參與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和降解，維持軟骨結構和功能，其功能異常是骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素[11]。IL-1β可誘導軟骨細胞凋亡、炎性反應及基質(zhì)降解，損傷軟骨組織，促進骨關節(jié)炎的發(fā)展進程，常用于誘導軟骨細胞建立軟骨細胞損傷模型[12]。本研究顯示，IL-1β作用于軟骨細胞后，細胞對IL-6、TNF-α和IFN-γ炎性因子的分泌增加，且細胞凋亡加劇，與已有的相關報道結果[13,14]一致，表明IL-1β誘導的軟骨細胞損傷模型建立成功。

咪達唑侖是手術常用的鎮(zhèn)痛劑。研究顯示，咪達唑侖可通過下調(diào)β-淀粉樣前體蛋白水解酶1(BACE1)進而減少Aβ1-42的表達減輕氧糖剝奪誘導的神經(jīng)細胞損傷[15]。IL-1β作為炎癥的始動因子，可通過刺激TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌和抑制膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子等的合成來干擾軟骨細胞代謝，抑制軟骨細胞基質(zhì)合成，引發(fā)關節(jié)炎癥[16]。IFN-γ也是介導骨關節(jié)炎等多種炎癥疾病發(fā)生發(fā)展的炎性因子，其還可刺激細胞分泌IL-6等炎性因子[17]。本研究顯示，咪達唑侖抑制了IL-1β誘導的軟骨細胞分泌IL-6、TNF-α和IFN-γ炎性因子，說明咪達唑侖可降低軟骨細胞炎性損傷。

細胞凋亡是一種受多種基因調(diào)控的程序性死亡過程。Bax和Bcl-2在細胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Bax表達升高時形成同源二聚體，改變線粒體膜通透性，導致細胞色素C釋放增加，進而激活Caspase凋亡途徑，誘導細胞凋亡[18]。而Bcl-2是一種抗凋亡分子，其表達增加可與Bax結合形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用。本研究顯示，咪達唑侖可呈劑量依賴性降低IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡率及細胞中Bax蛋白表達，而促進Bcl-2蛋白表達，說明咪達唑侖可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。

miRNA是一類長18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，在真核生物中廣泛存在，與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究表明，miR-145[19]、miR-124[20]、miR-155[21,22]等多種miRNA參與調(diào)控軟骨細胞炎性因子表達及細胞凋亡，可作為軟骨損傷治療的分子靶點。研究顯示，上調(diào)miR-382-3p表達可抑制RhoC/ROCK1信號通路降低N-甲基L-D-天冬氨酸(NMDA)誘導的HT22細胞氧化應激和細胞凋亡，減輕了HT22細胞損傷[23]。

本研究顯示，過表達miR-382-3p可降低IL-1β誘導的軟骨細胞分泌IL-6、TNF-α和IFN-γ炎性因子，并抑制細胞凋亡，與焦建寶等[24]報道的結果一致，說明miR-382-3p可作為軟骨細胞損傷的治療靶點。本研究還顯示，咪達唑侖呈劑量依賴性降低了IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-382-3p的表達，而敲減miR-382-3p部分逆轉(zhuǎn)了咪達唑侖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達及細胞凋亡的抑制作用，提示咪達唑侖可能通過下調(diào)miR-382-3p來抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達及細胞凋亡。

綜上所述，咪達唑侖可降低IL-1β誘導的軟骨細胞炎性因子表達及細胞凋亡，減輕軟骨細胞損傷，其作用機制可能與上調(diào)細胞中miR-382-3p表達有關。