蔡蕭君,王 欽,江柏華,劉 松,李 宇,吳圓圓,胡 楊,頡彥鵬(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院內(nèi)分泌科,哈爾濱 150036;通訊作者,E-mail:ssycxj@163.com)

肺纖維化是一種病因不明的致死性肺部疾病。患者表現(xiàn)為肺功能減退、呼吸困難和干咳[1-7]。異常的肺泡上皮傷口愈合和促纖維化途徑的激活被認(rèn)為是肺纖維化的主要始發(fā)事件[8]。在不確定的情況下,臨床診斷需要兼容的放射學(xué)成像技術(shù)及侵入性方法,如支氣管鏡和外科肺活檢等,給患者及家庭帶來(lái)極大的壓力和痛苦。目前,肺纖維化的病理生理機(jī)制尚不完全清楚,且患者可能會(huì)長(zhǎng)期伴有呼吸困難等癥狀,長(zhǎng)此以往會(huì)誘發(fā)患者心理上的障礙,導(dǎo)致抑郁癥等心理疾病[9,10]。因此,針對(duì)性地診斷兩種疾病的“結(jié)合狀態(tài)”是有效治療的關(guān)鍵。

丹貝益肺方出自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,由江柏華教授自擬經(jīng)驗(yàn)而成;組成為丹參、黃芪、平貝、黨參、麥冬、桔梗、川芎、桃仁、五味子、補(bǔ)骨脂、地龍等;其對(duì)肺纖維化療效確切[11-26]。但其組方復(fù)雜、體內(nèi)作用機(jī)制不明確,這嚴(yán)重影響了該方劑的臨床有效應(yīng)用。本研究采用最新的非靶向的、高通量的糞便代謝組學(xué)技術(shù),在無(wú)損傷的前提下獲取生物體全面的生物學(xué)信息,為客觀、全面認(rèn)識(shí)肺纖維化伴抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和有效藥物的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

UltiMate 3000-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó),Thermo Fisher公司);Toledo MS204TS電子天平分析天平(美國(guó)梅特勒-托利多公司);酶標(biāo)儀(MS芬蘭,型號(hào):Labsystems Multiskan);ZJHK-40L超純水機(jī)(天津卓精虹科儀器設(shè)備技術(shù)有限公司);丹參、平貝、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補(bǔ)骨脂、麥冬、五味子購(gòu)自于哈爾濱世一堂有限公司,經(jīng)蔡蕭君教授鑒定為正品;水合氯醛(上海源葉生物技術(shù)有限公司);谷胱甘肽試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒購(gòu)自于京建成生物工程研究所(批號(hào)20191101、20190204、20191112);IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):ml063132);IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):ml064292);TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):ml077385);博萊霉素:日本化藥株式會(huì)社;脂多糖(Sigma-Aldrich公司,批號(hào):L2630-100 mg)。

1.2 動(dòng)物

雄性清潔級(jí)SD大鼠30只,體質(zhì)量(150±20)g;黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(黑)2019-0004);飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(22 ±5)℃,濕度54% ±19%;給與大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。為排除性別因素引入的系列干擾,且考慮肺纖維化伴抑郁復(fù)合模型對(duì)動(dòng)物體質(zhì)要求較高,故本實(shí)驗(yàn)選取健康雄性SD大鼠。

1.3 丹貝益肺方溶液配制

丹貝益肺方由丹參、貝母、川芎、桃仁、地龍、黃芪、黨參片、麥冬、五味子、補(bǔ)骨脂、桔梗等組成,藥物飲片由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥局提供,水煎濃縮制成生藥濃度為0.6 g/ml的水煎液[26],大鼠灌胃劑量為6 g/kg。

1.4 模型復(fù)制及樣本制備

健康雄性SD大鼠24只,根據(jù)實(shí)驗(yàn)第0天體質(zhì)量隨機(jī)分為三組,即對(duì)照組、模型組、丹貝益肺方組。所有大鼠在適應(yīng)環(huán)境1周后給與10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,對(duì)照組大鼠氣管內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液,同時(shí)腹腔注射無(wú)菌生理鹽水,每日1次,連續(xù)4 d。模型組及丹貝益肺方組大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素(5 mg/kg),同時(shí)連續(xù)4 d腹腔注射脂多糖(0.5 mg/kg)建立抑郁模型[27],造模1 d后丹貝益肺方組大鼠灌胃給與丹貝益肺方進(jìn)行干預(yù)(每天1次,劑量6 g/kg),連續(xù)28 d。收集所有組實(shí)驗(yàn)第28天糞便,-80 ℃保存,以電子天平精確稱(chēng)取100 mg的糞便樣品,置于1.5 ml的離心管中,加入2 ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.0);渦旋震蕩10 min、超聲15 min,離心(12 000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液400 μl用于代謝組學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)第29天,以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,血清樣本和大腦前額皮質(zhì)組織用于1.5部分檢測(cè)生化指標(biāo)。其中收集的新鮮血液樣本靜置30 min后離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min),取上清液置于-80 ℃保存,腦組織置于液氮環(huán)境5 min后-80 ℃保存。

1.5 檢測(cè)各組大鼠MDA、GSH、SOD、IL-1β、IL-6、TNF-α活性

分離的大腦前額葉皮質(zhì)制備組織勻漿,離心(4 ℃,12 000 r/min,10 min),收集上清液,采用生化分析儀測(cè)定MDA、GSH、SOD含量,按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。

1.6 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)階段隔1星期進(jìn)行1次水迷宮實(shí)驗(yàn),記錄各組大鼠找到平臺(tái)花費(fèi)時(shí)間。

1.7 糞便代謝組學(xué)分析條件

UltiMate 3000-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó),Thermo Fisher公司),柱溫45 ℃,流速0.4 ml/min,錐孔電壓正離子3 500 V、負(fù)離子2 500 V。流動(dòng)相A(0.1%甲酸水),流動(dòng)相B(0.1%乙腈)。糞便代謝物梯度洗脫條件:0～1 min,98%A;1～2 min,95%～80%A;2～6 min,80%～40%A;6～10 min,40%～98%A。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Compound Discoverer 3.2小分子數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),將獲取到的Raw文件直接帶入,并進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)處理流程,以Student’sttest,P<0.05且倍數(shù)差(fold change)>1的值為差異代謝物標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合開(kāi)源的MzCloud標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。生化指標(biāo)采用SPSS 18軟件以Student’sttest進(jìn)行單變量分析比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)結(jié)果

各組大鼠前額皮質(zhì)中IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA、GSH和SOD的表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,丹貝益肺方組IL-1β、IL-6和TNF-α均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組MDA、GSH、SOD顯著降低(P<0.05);與模型組比較,丹貝益肺方組MDA、GSH和SOD指標(biāo)均顯著增加(P<0.05)。

表1 各種大鼠肺纖維化及抑郁癥生化指標(biāo)結(jié)果

2.2 大鼠定位航行能力結(jié)果

與對(duì)照組相比,模型組大鼠定位平臺(tái)時(shí)間顯著增加(P<0.05);與模型組相比,丹貝益肺方組定位平臺(tái)的時(shí)間明顯減少(P<0.01)。說(shuō)明模型組大鼠定位能力下降,給予丹貝益肺方有明顯回調(diào)作用。

表2 大鼠水迷宮定位航行結(jié)果

2.3 大鼠糞便代謝組學(xué)研究

通過(guò)主成分分析可知,三組大鼠的糞便的代謝輪廓聚類(lèi)明顯,由組間聚類(lèi)可知對(duì)照組和模型組分離明顯(見(jiàn)圖1),證明肺纖維化伴抑郁癥大鼠的整體代謝發(fā)生變化,致使與健康狀態(tài)大鼠發(fā)生顯著分離,給與丹貝益肺方治療后,發(fā)生回調(diào),部分大鼠整體代謝狀態(tài)與對(duì)照組一致,證明丹貝益肺方對(duì)肺纖維化伴抑郁癥的療效顯著。

圖1 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便PCA得分圖Figure 1 Fecal PCA score of rats with pulmonary fibrosis and depression

進(jìn)一步通過(guò)火山圖篩選生物標(biāo)記物,對(duì)空白組和模型組代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)及Fold Change分析,生物標(biāo)記物結(jié)果見(jiàn)表3,圖2。

與模型組比,丹貝益肺方組5個(gè)生物標(biāo)記物有降低趨勢(shì),但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)獲取到的5個(gè)生物標(biāo)記物進(jìn)行代謝通路分析可知,肺纖維化伴抑郁癥大鼠主要涉及色氨酸代謝和嘌呤代謝(見(jiàn)圖3)。為可視化丹貝益肺方在治療肺纖維化合并抑郁癥的作用機(jī)制,將涉及的標(biāo)記物及關(guān)鍵代謝酶帶入Cytoscape3.2.1軟件進(jìn)行通路分析,繪制針對(duì)“肺纖維化伴抑郁癥的代謝通路圖”。如圖3所示,本次復(fù)合模型得到的5個(gè)生物標(biāo)記物中,只有3個(gè)涉及在代謝網(wǎng)絡(luò)中,即犬尿酸、肌苷和硫酸雄甾酮。此代謝過(guò)程涉及多個(gè)代謝酶及代謝產(chǎn)物,且上述3種代謝酶都處于核心位置,將多個(gè)代謝酶及其他成分進(jìn)行關(guān)聯(lián),由此推斷丹貝益肺方可能通過(guò)上述靶標(biāo)的調(diào)節(jié)達(dá)到整體調(diào)節(jié)代謝通路、有效干預(yù)代謝通路中其他代謝成分的目的。

表3 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便生物標(biāo)志物信息

圓圈代表代謝物,紅色和綠色圓圈代表FC小于1,同時(shí)t檢驗(yàn)絕對(duì)值小于0.05的代謝組,藍(lán)色圓圈為符合標(biāo)準(zhǔn)的代謝物圖2 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便火山圖Figure 2 Fecal volcanogram of rats with pulmonary fibrosis and depression

3 討論

臨床上肺纖維化患者因長(zhǎng)期患病對(duì)生活和工作引入生理及病理狀態(tài),多數(shù)伴有不同程度的抑郁癥發(fā)生。精準(zhǔn)針對(duì)及有效預(yù)防此類(lèi)復(fù)合型疾病的應(yīng)對(duì)措施是控制這一發(fā)病率高、危害性大疾病的有效手段。本研究采用高通量的組學(xué)技術(shù)對(duì)糞便代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析,在對(duì)生物體無(wú)損傷的前提下發(fā)現(xiàn)了與抑郁癥相關(guān)的一系列代謝物變化,為臨床抑郁癥生物標(biāo)記物及有效診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

模型組大鼠糞便代謝物中一致地發(fā)現(xiàn)溶血磷脂膽堿(LysoPC)成分的顯著性變化,LysoPC是溶血磷脂酸的前體,溶血磷脂酸是一種具有生物活性的甘油磷脂。在脂肪酸的長(zhǎng)度和飽和度上,存在多種不同的溶血磷脂酸類(lèi)型。溶血磷脂酸涉及全身性硬化或多發(fā)性硬化、神經(jīng)性硬化、溶血磷脂酸炎癥、胚胎性硬化。溶血磷脂酸通過(guò)上皮細(xì)胞死亡、血管滲漏和成纖維細(xì)胞遷移和增殖誘導(dǎo)肺、腎和肝纖維化[28-30]。溶血磷脂酸受體1的基因抑制和自體毒素酶的拮抗都可以預(yù)防肺纖維化。溶血磷脂酸受體1缺陷小鼠在博萊霉素?fù)p傷后沒(méi)有發(fā)生肺纖維化[31]。此外,溶血磷脂酸受體2基因敲除小鼠在應(yīng)用博萊霉素后不會(huì)出現(xiàn)肺纖維化。此外,人肺成纖維細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)受到抑制[32]。目前,溶血磷脂酸的來(lái)源尚不清楚。溶血磷脂酸的生產(chǎn)至少有兩種不同的來(lái)源。一種是磷脂酶A1和A2水解細(xì)胞膜上的磷脂酸。但大多數(shù)溶血磷脂酸是由溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰絲氨酸的酶切產(chǎn)生的,溶血磷脂酰絲氨酸是由溶血磷脂酰磷酸酶D活性的自毒素(ATX)產(chǎn)生的。在肺纖維化患者體內(nèi)上皮細(xì)胞損傷,特別是2型肺泡上皮細(xì)胞,被認(rèn)為是引發(fā)纖維化過(guò)程的原因。肺損傷后,二棕櫚酰磷脂酰膽堿作為主要的表面活性物質(zhì)脂質(zhì)成分,被2型肺泡上皮細(xì)胞的磷脂酶A2活性降解為溶血磷脂酰膽堿。這與本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的模型組大鼠糞便代謝物中LysoPC表達(dá)水平升高一致。給與丹貝益肺方進(jìn)行治療后,其含量有降低趨勢(shì),證明丹貝益肺方能靶向性調(diào)節(jié)磷脂酶A2活性,最終達(dá)到調(diào)節(jié)代謝物L(fēng)ysoPC含量的目的。

犬尿酸與抑郁癥有極為密切的關(guān)系,抗抑郁藥治療前抑郁癥患者血漿犬尿酸濃度與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系最為顯著。然而,是否有代謝物或單核苷酸多態(tài)性基因型可能與抑郁癥癥狀的基線嚴(yán)重程度相關(guān)尚不清楚。抑郁癥的病理生理幾乎肯定是異質(zhì)性的。大量的數(shù)據(jù)支持單胺類(lèi)神經(jīng)傳遞的變異有助于抑郁癥病理生理學(xué)的假說(shuō)。此外,炎癥也可能在抑郁癥病理生理學(xué)中起重要作用。與非抑郁癥患者相比,抑郁癥患者的促炎性細(xì)胞因子濃度已顯示出增加,并且與抑郁癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[33-35]。此外,感染、內(nèi)毒素暴露、細(xì)胞因子的治療性應(yīng)用和心理壓力都會(huì)引發(fā)炎癥并導(dǎo)致抑郁癥狀。腸道微生物相關(guān)的炎性細(xì)胞因子釋放也可能是通過(guò)“微生物群—腸道—大腦”軸導(dǎo)致抑郁癥狀的機(jī)制。重要的是,具有高水平炎癥的抑郁癥患者對(duì)傳統(tǒng)的抗抑郁治療反應(yīng)不佳,但他們可能對(duì)細(xì)胞因子拮抗劑有反應(yīng)。此外,“神經(jīng)傳遞”和“炎癥”假說(shuō)并不相互排斥,可能與色氨酸代謝有關(guān)。色氨酸是5-羥色胺和犬尿酸的前體。鑒于5-羥色胺神經(jīng)傳遞的重要性,色氨酸代謝從5-羥色胺分流到犬尿酸生物合成途徑可能有助于抑郁癥的病理生理學(xué)?！叭蛩嵬緩健钡牡谝徊接蛇胚岚?,3-雙加氧酶1和吲哚胺2,3-雙加氧酶1或色氨酸2,3-雙加氧酶2催化。炎性細(xì)胞因子可增加吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達(dá),從而激活“犬尿酸途徑”,導(dǎo)致出現(xiàn)抑郁樣行為。犬尿酸與5-羥色胺不同,它能穿過(guò)血腦屏障,大腦中的大部分犬尿酸來(lái)源于外周血。犬尿隨后被犬尿酸途徑氨基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步代謝,產(chǎn)生下游代謝物,例如具有神經(jīng)保護(hù)作用的犬尿喹啉酸。這些下游代謝物可通過(guò)其對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸受體的作用在疾病病理生理學(xué)中發(fā)揮作用。這可能是導(dǎo)致抑郁癥癥狀的機(jī)制。綜上所述,本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的犬尿酸含量異常與模型中抑郁癥的表現(xiàn)一致,給與丹貝益肺方治療后呈顯著回調(diào)趨勢(shì),在以方驗(yàn)證的同時(shí),證實(shí)了犬尿酸與肺纖維化伴抑郁癥的高度相關(guān)性,由下游代謝物的含量變化推測(cè)丹貝益肺方可能通過(guò)干預(yù)上游的5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的活性,達(dá)到干預(yù)疾病的目的,同時(shí)犬尿酸可能作為肺纖維化伴抑郁癥的有效的臨床診斷方式之一。

圖3 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便代謝通路圖Figure 3 Fecal metabolic pathway of rats with pulmonary fibrosis and depression

通過(guò)上述針對(duì)性的聚焦分析發(fā)現(xiàn),本次得到的5個(gè)糞便生物標(biāo)記物對(duì)肺纖維化伴抑郁癥有直接相關(guān)的內(nèi)在聯(lián)系;通過(guò)給與丹貝益肺方后得到有效回調(diào),這驗(yàn)證了生物標(biāo)記物與疾病及藥物的高度響應(yīng)程度;通過(guò)代謝通路分析發(fā)現(xiàn),丹貝益肺方對(duì)肺纖維化伴抑郁癥有良好的療效。調(diào)節(jié)嘌呤代謝、色氨酸代謝通路可能是其治療肺纖維化伴抑郁癥的作用機(jī)制。