陳加輝，何 建，周 瑞，鄭 楠

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬怡寧老年醫(yī)院八病區(qū)，浙江溫州 325000

暴發(fā)性心肌炎(fulminant myocarditis，F(xiàn)M)是急性心肌炎中最嚴(yán)重的一種，可導(dǎo)致嚴(yán)重的血流動(dòng)力學(xué)障礙、急性心力衰竭，甚至猝死，死亡率高達(dá)40%～70%[1- 3]。暴發(fā)性心肌炎的病因多種多樣，包括病毒感染、免疫和過(guò)敏因素。暴發(fā)性心肌炎的診斷很復(fù)雜，更傾向于臨床診斷，而不是組織學(xué)或病理學(xué)診斷[4]。部分FM患者心電圖表現(xiàn)為ST段抬高，酷似心肌梗死(myocardial infarction，MI)，常誤診為急性MI，而早期正確的診斷可能有助于治療，并降低死亡率。目前的實(shí)驗(yàn)室檢查如肌鈣蛋白I或T、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、腦利鈉肽等被用于心血管疾病的臨床診斷。然而，這些生物標(biāo)志物的表達(dá)水平在心肌損傷和心功能不全期間變化很大，對(duì)暴發(fā)性心肌炎的診斷缺乏特異性。因此，迫切需要新的具有更高靈敏度和特異度的生物標(biāo)志物來(lái)診斷暴發(fā)性心肌炎。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種小的非編碼RNA，通過(guò)與靶miRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合而導(dǎo)致基因沉默，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miRNA可能以穩(wěn)定的形式存在于血漿或血清中，某些循環(huán)中的miRNA，如miR- 29b、miR- 125b和miR- 22，在心力衰竭中起著重要作用，可作為預(yù)測(cè)心力衰竭的生物標(biāo)志物[5- 9]。循環(huán)中的miR- 125b是心臟驟停后生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[9]。然而，循環(huán)miRNA是否可以作為成人FM的生物標(biāo)志物尚不清楚。本研究旨在研究FM患者外周血中miRNA的表達(dá)譜特征，并尋找可能用于FM診斷的生物標(biāo)志物。

對(duì)象和方法

對(duì)象隨機(jī)數(shù)字表法選取2019年6月至2020年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬怡寧老年醫(yī)院入院的10例FM患者、10例MI患者和7名健康受試者為研究對(duì)象。FM組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床診斷為FM患者；(2)急性心力衰竭在2周內(nèi)迅速出現(xiàn)癥狀；(3)嚴(yán)重血流動(dòng)力學(xué)損傷；(4)早期(入院第1～2 d)使用機(jī)械循環(huán)支持，如主動(dòng)脈內(nèi)氣囊反搏和/或靜脈-動(dòng)脈體外膜肺氧合。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為急性MI。MI組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：符合第4版MI全球定義中關(guān)于急性MI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括典型的胸痛等心肌缺血癥狀、心電圖動(dòng)態(tài)演變、心肌標(biāo)志物異常增高等[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<12歲；(2)無(wú)法進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影以區(qū)分FM和MI的患者；(3)因膿毒癥、化療藥物或毒物引起的心肌損傷；(4)血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定或低血容量引起的休克；(5)患有先天性心臟病、瓣膜性心臟??；(6)嚴(yán)重肝腎功能不全。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)高血壓、冠心病、風(fēng)濕性心臟病及原發(fā)性心肌病史，亦無(wú)藥物性、中毒性、代謝性、膠原病等所致的其他特異性心肌病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<12歲；(2)妊娠期或哺乳期。本研究通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬怡寧老年醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(倫理審查編號(hào)：K20190218)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

miRNA微陣列分析獲取受試者的血漿樣本并提取RNA用于miRNA微陣列分析。采用TRIzol LS(Invitgen，USA)提取總RNA后使用RNasy mini試劑盒(擎科生物技術(shù)有限公司)純化，NanoDrop ND- 1000測(cè)定儀測(cè)定RNA的含量和質(zhì)量，檢測(cè)RNA在260 nm和280 nm處的吸光度比值，采用Agilent miRNA全標(biāo)記芯片系統(tǒng)和Hyb試劑盒(安捷倫生物有限公司)進(jìn)行miRNA微陣列樣品標(biāo)記和陣列雜交，使用安捷倫微陣列掃描儀清洗、固定和掃描雜交陣列。將掃描圖像導(dǎo)入Axon GenePix Pro 6.0軟件進(jìn)行網(wǎng)格對(duì)齊和數(shù)據(jù)提取。

實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miRNA表達(dá)在7900HT快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Life Technologies，USA)上檢測(cè)miRNA的表達(dá)，定量PCR設(shè)置：95℃ 10 min、95℃ 10 s、60℃ 10 s和72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，miRNA引物由格魯斯特生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，以U6為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)2-ΔΔCt相對(duì)定量方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

生物信息分析通過(guò)TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，使用David生物信息資源(https：//david.ncifcrf.gov/)對(duì)所選基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

體外實(shí)驗(yàn)人心肌細(xì)胞系H9C2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到24孔板，將miR- 29b模擬物(miR- 29b mimic)、miR- 125b模擬物(miR- 125b mimic)，模擬物陰性對(duì)照物(NC mimic)轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞使用PBS進(jìn)行處理(溶劑對(duì)照組)，并設(shè)置未做任何處理的對(duì)照組，24 h后收集H9C2細(xì)胞及其上清液進(jìn)行相關(guān)分析。使用ELISA試劑盒(阿拉丁試劑有限公司)檢測(cè)H9C2細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、IL- 10水平。CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞活力。通過(guò)蛋白免疫印跡分析蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)用于分析細(xì)胞凋亡。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。對(duì)非正態(tài)分布的變量進(jìn)行Mann WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，通過(guò)受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線(xiàn)分析miRNA對(duì)FM的診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況FM患者中男性7例、女性3例，平均年齡(37.8±4.32)歲；發(fā)熱4例，胸悶3例，胸痛3例；肌鈣蛋白(37 652.85±3472.62) pg/ml，腦鈉肽(9938.63±1305.72) pg/ml，白細(xì)胞(9.36±2.31)×109/L，中性粒細(xì)胞(8.32±1.78)×109/L，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(178.35±23.16) U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(447.29±56.93) U/L；MRI檢查顯示6例心肌水腫；患者中6例采用主動(dòng)脈內(nèi)球囊反搏(intra-aortic balloon pump，IABP)，4例采用體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)，4例采用連續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy，CRRT)，1例采用抗病毒糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療。MI患者中男性6例、女性4例，平均年齡(36.09±5.08)歲。健康受試者中男性4例、女性3例，平均年齡(35.23±5.12)歲。

循環(huán)miRNA圖譜miRNA微陣列分析結(jié)果顯示，所有受試組共檢測(cè)到1325個(gè)miRNA。與健康對(duì)照組相比，F(xiàn)M患者組hsa-miR- 29b(t=6.926，P=0.018)、hsa-miR- 125b(t=8.218，P=0.003)和hsa-miR- 200c- 3p(t=6.335，P=0.026)表達(dá)顯著上調(diào)，而hsa-miR- 142表達(dá)顯著下調(diào)(t=9.536，P=0.001)。與健康對(duì)照組相比，MI患者組hsa-miR- 29b(t=11.257，P<0.001)、hsa-miR- 200c- 3p(t=2.084，P=0.502)和hsa-miR- 142(t=3.017，P=0.218)的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而hsa-miR- 125b的表達(dá)水平明顯升高(t=9.861，P=0.001)。

實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)miRNA表達(dá)的檢測(cè)與健康對(duì)照組相比，F(xiàn)M患者組血漿中miR- 29b(t=18.925，P<0.001)、miR-125b(t=5.981，P=0.029)和miR- 200c- 3p(t=6.044，P=0.027)的表達(dá)水平顯著上調(diào)，miR- 142的表達(dá)水平顯著下調(diào)(t=14.996，P<0.001)；而MI組血漿中僅miR- 125b的表達(dá)水平顯著上調(diào)(t=5.329，P=0.031)(圖1)。

與治療前相比，治療后FM患者組左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)顯著增加(t=8.206，P=0.003)，而N末端B型利鈉肽前體(N-terminal B-type natriuretic peptide precursor，NT-proBNP)(t=7.154，P=0.019)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I，cTnI)(t=6.026，P=0.028)的表達(dá)水平顯著下降。治療后FM患者組miR- 29b(t=12.943，P<0.001)和miR- 125b(t=14.016，P<0.001)的表達(dá)水平顯著下調(diào)，恢復(fù)至正常水平；而miR- 200c- 3p(t=1.996，P=0.401)和miR- 142(t=2.752，P=0.392)的表達(dá)水平與治療前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

KEGG通路分析潛在的生物標(biāo)志物對(duì)miRNA的靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，miR- 29b靶點(diǎn)參與多種途徑，尤其是炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑，如T細(xì)胞或B細(xì)胞受體、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移、趨化因子信號(hào)通路，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，AKT)通路等；miR- 125b靶點(diǎn)參與細(xì)胞生存相關(guān)的通路，如凋亡、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和PI3K-AKT通路(圖2)。

FM：暴發(fā)性心肌炎；MI：心肌梗死

miR- 29b和miR- 125b的生物學(xué)作用ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR- 29b模擬物和miR- 125b模擬物轉(zhuǎn)染后可明顯上調(diào)IL- 1β(t=8.217，P=0.003；t=7.981，P=0.009)、IL- 6(t=16.817，P<0.001；t=8.725，P=0.001)、IL- 10(t=8.106，P=0.007；t=8.992，P=0.001)、TNF-α(t=14.925，P<0.001；t=11.367，P<0.001)的表達(dá)水平(圖3A)。細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)顯示，與miR- 125b模擬物相比，轉(zhuǎn)染miR- 29b模擬物對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更加明顯(χ2=6.168，P=0.047)，而兩組細(xì)胞增殖抑制情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.452，P=0.417)(圖3B、C)。蛋白免疫印跡分析顯示，與對(duì)照組相比，miR- 29b模擬物和miR- 125b模擬物轉(zhuǎn)染后可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax和活化的半胱天冬酶- 3(cleaved casepase- 3，CCS- 3)的水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl- 2和增殖蛋白C-myc的表達(dá)(圖3D)。

循環(huán)miRNA表達(dá)與FM嚴(yán)重程度的相關(guān)性線(xiàn)性相關(guān)分析顯示，miR- 29b和miR- 125b表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.67，P=0.071；r=-0.49，P=0.003)，與cTnI濃度(r=0.61，P=0.019；r=0.52，P=0.016)、干擾素β(interferon β，IFN-β)濃度(r=0.42，P=0.014；r=0.36，P=0.021)以及心肌水腫面積(r=0.86，P=0.005；r=0.73，P=0.013)呈顯著正相關(guān)。

miR- 29b和miR- 125b的診斷準(zhǔn)確性繪制并分析ROC曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，miR- 29b診斷FM的曲線(xiàn)下面積(area under curve，AUC)為0.872，miR- 125b診斷FM的AUC為0.825，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.654，P=0.218)。與miR- 125b相比，miR- 29b具有較高的靈敏度(93.6%比89.2%；t=0.896，P=0.795)和特異度(72.4%比.59.6%；t=9.478，P=0.002)(圖4)。

討 論

FM發(fā)病急、進(jìn)展快，可導(dǎo)致嚴(yán)重心力衰竭甚至猝死。及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷是挽救生命的關(guān)鍵[9]。目前，診斷可疑心肌炎的生物標(biāo)志物有限，納入包括病史、臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查的綜合策略有助于提高FM診斷的準(zhǔn)確率。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)患者出現(xiàn)起病突然、病毒感染首發(fā)癥狀明顯(如發(fā)熱、咳嗽、胃痛等)、迅速出現(xiàn)嚴(yán)重血流動(dòng)力學(xué)障礙、心肌損傷嚴(yán)重、室壁運(yùn)動(dòng)彌漫性減弱等癥狀時(shí)，可作出FM的臨床診斷[1- 3]。而按照Louise標(biāo)準(zhǔn)臨床診斷為FM時(shí)，組織學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)和間質(zhì)水腫、充血、毛細(xì)血管滲漏以及細(xì)胞壞死和纖維化，當(dāng)基于組織學(xué)特征表現(xiàn)中有2個(gè)或2個(gè)以上為陽(yáng)性時(shí)，預(yù)測(cè)FM的診斷準(zhǔn)確率為78%～82%。在本研究中，F(xiàn)M的診斷主要基于中國(guó)心臟病學(xué)會(huì)專(zhuān)家共識(shí)聲明和國(guó)際心肌炎心血管磁共振共識(shí)小組聲明中的臨床癥狀和心血管磁共振表現(xiàn)[4]。

FM是一種進(jìn)展迅速的疾病，需要早期快速診斷，但目前可疑心肌炎的診斷生物標(biāo)志物有限。近年研究表明，miRNA在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用，可作為多種疾病的診斷生物標(biāo)志物[3- 9]。傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR分析需要至少1.5 h才能檢測(cè)到miRNA的表達(dá)，然而隨著技術(shù)的進(jìn)步，新的實(shí)時(shí)定量PCR方法和檢測(cè)儀器可將檢測(cè)時(shí)間縮短至30 min，為FM的快速診斷提供了基礎(chǔ)[9- 10]。本研究對(duì)FM患者的血液樣本進(jìn)行miRNA譜分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)M患者循環(huán)miR- 29b、miR- 125b和miR- 200c- 3p的表達(dá)水平上調(diào)，當(dāng)臨床癥狀恢復(fù)后，miR- 29b和miR- 125b水平降至正常水平，提示其在FM中可能作為潛在的生物標(biāo)志物。MiR- 29b與心肌功能密切相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道?；撬嵘险{(diào)基因1通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)miR- 29b的表達(dá)而減輕脂多糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷，促進(jìn)H9c2細(xì)胞的存活而抑制細(xì)胞凋亡、炎癥以及核因子κB和Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路的磷酸化激活[11]。本研究KEGG通路分析顯示，miR- 29b靶點(diǎn)參與多種途徑，尤其是炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑，且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用miR- 29b模擬物轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞損傷明顯，心肌細(xì)胞中炎癥因子的釋放水平顯著增加。另有研究指出CVB3病毒刺激可通過(guò)上調(diào)miR- 125b促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴(lài)的細(xì)胞凋亡，并抑制其靶基因Fas相關(guān)磷酸酶1的表達(dá)，從而在CVB3誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中起決定性作用[12- 13]。miR- 125b靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞生存相關(guān)通路，如凋亡、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等途徑。綜合上述結(jié)果，提示miR- 29b和miR- 125b靶基因主要參與炎癥和免疫應(yīng)答，初步表明miR- 29b和miR- 125b可能通過(guò)這些途徑參與FM的發(fā)生。進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示，miR- 125b和miR- 29b在FM和MI患者血漿中的表達(dá)升高，且與LVEF值呈負(fù)相關(guān)，提示miR- 29b和miR- 125b的表達(dá)與心肌損傷有關(guān)。而miR- 125b與cTnI之間的相關(guān)性相對(duì)于miR- 29b較弱，可能是因?yàn)閙iR- 125b可來(lái)源于心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞，而cTnI和miR- 29b主要來(lái)源于心肌細(xì)胞，且血漿中cTnI的高表達(dá)通常是由于心肌細(xì)胞的死亡，如心肌梗死后的凋亡和壞死所致。此外，ROC曲線(xiàn)分析顯示，miR- 29b對(duì)FM診斷具有較高的靈敏度和特異度。

圖2 miR- 29b靶基因(A)和miR- 125b靶基因(B)的KEGG通路分析圖

IL：白細(xì)胞介素；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；TNF-α：腫瘤壞死因子α；BAD：Bcl- 2相關(guān)死亡啟動(dòng)因子；CCS- 3：活化的半胱天冬酶- 3

圖4 miR- 29b和miR- 125b診斷FM的受試者工作特征曲線(xiàn)

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR- 125b和miR- 29b在FM患者血液中的表達(dá)水平升高，且與FM嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。此外，相較于miR- 125b，miR- 29b對(duì)FM診斷具有相對(duì)較高的靈敏度和特異度，可作為FM的潛在生物標(biāo)志物。