李 帥，鄭振中，張宇鵬，劉子群 ，肖什朋，歐陽正曉，王 冰

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 1脊柱外科 2骨科，長沙 410011

骨肉瘤是骨組織中侵襲性最強(qiáng)的惡性腫瘤之一，好發(fā)于兒童和青少年[1]，15%～20%骨肉瘤患者在首次確診時(shí)就伴有肺轉(zhuǎn)移[2- 3]。根據(jù)組織學(xué)表現(xiàn)，可將其分為高級(jí)別、中級(jí)別及低級(jí)別骨肉瘤3種類型[4]。盡管新輔助化療的出現(xiàn)與應(yīng)用，讓骨肉瘤的治療有了更多的選擇和突破，但患者的總體生存率并沒有明顯改變[5]。因此，尋找骨肉瘤新的預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)是非常有必要的。近年來，多種公共數(shù)據(jù)庫被廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的研究，并且微陣列技術(shù)在基因分析中起著越來越重要的作用?；虮磉_(dá)譜數(shù)據(jù)庫是醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)中的一個(gè)重要工具，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[6- 8]。隨著大量基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的研究及基因微陣列技術(shù)的應(yīng)用，表明差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)參與多種生物過程、途徑和分子功能[9- 10]。本研究通過基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫獲取與骨肉瘤相關(guān)的基因表達(dá)譜GSE16088和GSE12865，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出骨肉瘤潛在的關(guān)鍵基因(Hub基因)，并分析其免疫浸潤模式，為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制和治療策略研究提供新的方向。

資料和方法

數(shù)據(jù)來源及篩選在GEO公共數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并獲取GSE16088和GSE12865的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。GSE16088數(shù)據(jù)集基于GPL96平臺(tái)，其中包含14例骨肉瘤樣本和6例正常對(duì)照組織樣本的基因表達(dá)信息；GSE12865數(shù)據(jù)集基于GPL6244平臺(tái)，其中包含12例骨肉瘤樣本和2例正常人成骨細(xì)胞樣本的基因表達(dá)信息。

差異表達(dá)分析利用R軟件中的limma軟件包[11]，分別對(duì)兩組芯片的骨肉瘤樣本和正常對(duì)照樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，鑒定DEGs并繪制火山圖。以|log2FC|>1.5和校正后P<0.05為閾值篩選DEGs。采用維恩圖(https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)確定GSE16088和GSE12865數(shù)據(jù)集的交集基因。使用R軟件中的ggplot2軟件包繪制DEGs表達(dá)的熱圖。

DEGs功能富集分析利用生物學(xué)信息注釋及可視化數(shù)據(jù)庫(database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)(https：//david.ncifcrf.gov/)對(duì)骨肉瘤DEGs進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析。其中，GO功能注釋包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能分析來預(yù)測蛋白質(zhì)的功能[12]；KEGG富集分析會(huì)將DEGs富集在特定的通路，以構(gòu)建分子間的相互作用和關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[13]。

免疫細(xì)胞浸潤分析采用CIBERSORT算法預(yù)測GSE16088中腫瘤組織樣本與正常組織樣本的22種免疫細(xì)胞的浸潤情況[14]。22種免疫細(xì)胞包括7種類型的T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞、靜息記憶CD4+T細(xì)胞、活化記憶CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞)、3種類型的巨噬細(xì)胞(M0、M1和M2)以及幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞，靜息自然殺傷細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。以P<0.05篩選免疫細(xì)胞，使用R軟件分析22種免疫細(xì)胞在骨肉瘤和正常組織樣本中的浸潤情況。同時(shí)進(jìn)行主成分分析(principal components analysis，PCA)以確定骨肉瘤和正常組織樣本之間的差異。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因的篩選為了獲取基因間相互作用的關(guān)系，采用基因相互作用數(shù)據(jù)庫檢索工具(search tool for the retrieval of interacting genes，STRING)對(duì)已獲取的108個(gè)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[15]。篩選置信度得分≥0.9的互作蛋白[16]，網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)蛋白質(zhì)，連線代表蛋白質(zhì)之間的相互作用，去除網(wǎng)絡(luò)中游離的蛋白質(zhì)，通過Cytoscape軟件(https：//cytoscape.org/)的CytoHubba插件按基因節(jié)點(diǎn)的連接度篩選前5位Hub基因[17]。使用腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證Hub基因在骨肉瘤樣本及正常組織樣本中的表達(dá)情況。

結(jié) 果

DEGs的鑒定通過差異性表達(dá)分析從GSE16088數(shù)據(jù)集中鑒定出2089個(gè)DEGs，包括1327個(gè)上調(diào)基因和762個(gè)下調(diào)基因；從GSE12865數(shù)據(jù)集中鑒定出856個(gè)DEGs，包括521個(gè)上調(diào)基因和335個(gè)下調(diào)基因(圖1)。取GSE16088和GSE12865數(shù)據(jù)集的交集，最終鑒定出108個(gè)DEGs，構(gòu)建108個(gè)DEGs的表達(dá)熱圖(圖2)。在GSE16088和GSE12865數(shù)據(jù)集中，DEGs在骨肉瘤組與正常對(duì)照組之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.341，P=0.0031；t=3.726，P=0.0019)。

DEGs功能富集分析GO功能注釋結(jié)果顯示，DEGs主要富集于整合素結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)結(jié)構(gòu)成分和胞外基質(zhì)結(jié)合等(圖3)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，DEGs主要富集于ECM受體相互作用和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路(表1)。

免疫細(xì)胞浸潤分析經(jīng)過計(jì)算和篩選，得到14例骨肉瘤樣本和5例正常組織樣本的免疫細(xì)胞含量矩陣。22種免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果顯示，與其他免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞和B細(xì)胞等)相比，骨肉瘤樣本中巨噬細(xì)胞浸潤占主導(dǎo)地位(圖4A、B)。PCA分析顯示14例骨肉瘤樣本和5例正常組織樣本之間的免疫細(xì)胞浸潤模式具有明顯的個(gè)體差異(t=2.948，P=0.008)(圖4C)。M0型巨噬細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞之間相互作用最明顯(圖4D)。與正常組織樣本相比，骨肉瘤樣本M0型巨噬細(xì)胞浸潤程度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.101，P=0.002)(圖4E)。

PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hub基因識(shí)別及驗(yàn)證DEGs共有107個(gè)節(jié)點(diǎn)和145條邊參與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(圖5A)。對(duì)PPI中的連接度進(jìn)行評(píng)估，最終篩選出分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1，SPP1)、基質(zhì)金屬肽酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP2)、賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)、V型膠原蛋白α(II)鏈(collagen type V alpha 2 chain，COL5A2)、黑色素瘤細(xì)胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule，MCAM)5個(gè)Hub基因(圖5B)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證Hub基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SPP1(t=5.051，P=0.0005)、MMP2(t=3.714，P=0.0091)、LOX(t=4.504，P=0.0029)、COL5A2(t=2.514，P=0.0206)、MCAM(t=2.836，P=0.0172)在骨肉瘤樣本與正常組織樣本之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DEGs：差異表達(dá)基因；紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因

A.GSE16088；B.GSE12865

GO：基因本體

表1 DEGs的KEGG通路分析

A.22種免疫細(xì)胞在骨肉瘤和正常組織中的分布；B.熱圖顯示骨肉瘤和正常組織免疫細(xì)胞浸潤的差異；C.主成分分析中，骨肉瘤和正常組織間免疫細(xì)胞浸潤模式存在顯著差異(P=0.008)；D.22種免疫細(xì)胞的共表達(dá)熱圖；E.小提琴圖顯示免疫細(xì)胞浸潤差異

PPI：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

討 論

近年來，越來越多的來自GEO數(shù)據(jù)庫的微陣列數(shù)據(jù)被用來分析DEGs以揭示各類疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。差異性表達(dá)分析是根據(jù)|logFC|的大小來篩選DEGs，然后對(duì)其進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析。此外，還可以通過整合DEGs編碼的蛋白質(zhì)相互作用和microRNA-mRNA的相互作用形成一個(gè)完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，用來預(yù)測疾病潛在的關(guān)鍵基因和發(fā)病機(jī)制。

在本研究中，共檢測到108個(gè)DEGs，包括77個(gè)上調(diào)基因和31個(gè)下調(diào)基因。GO功能注釋和KEGG富集分析結(jié)果表明，DEGs主要富集于整合素結(jié)合、ECM結(jié)構(gòu)、ECM受體相互作用和PI3K/Akt信號(hào)通路。這些都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過CIBERSORT算法評(píng)估GSE16088中免疫細(xì)胞的浸潤模式，比較骨肉瘤樣本和正常組織樣本中免疫細(xì)胞浸潤模式的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中巨噬細(xì)胞是最重要的浸潤細(xì)胞。通過PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，篩選出5個(gè)Hub基因，包括SPP1、MMP2、LOX、COL5A2、MCAM，所有這些基因在骨肉瘤中均上調(diào)，并且在TCGA數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證這些基因在骨肉瘤樣本和正常組織樣本中的表達(dá)確實(shí)存在差異。

大量研究表明，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵一環(huán)，當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞間的連接減弱或消失時(shí)，腫瘤細(xì)胞就會(huì)從原發(fā)部位脫離并獲得侵襲和遷移的能力[18- 19]。腫瘤相關(guān)ECM也是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，由膠原結(jié)合整合素介導(dǎo)的ECM發(fā)生重組(如膠原沉積)可能會(huì)影響腫瘤的預(yù)后[20]。此外，DEGs富集在TGF-β、PI3K/Akt和Wnt等信號(hào)通路，表明這些通路與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β的過度表達(dá)與骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移有關(guān)[21]，并與骨肉瘤的惡性程度相關(guān)[22]。PI3K/Akt信號(hào)通路被認(rèn)為參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，越來越多的證據(jù)表明，該通路在骨肉瘤中被過度激活，并參與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡抑制、血管生成、轉(zhuǎn)移和化療耐藥等[23]。抑制Wnt通路可以逆轉(zhuǎn)EMT[24]，從而降低骨肉瘤的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)的DEGs主要富集于PI3K/Akt信號(hào)通路，表明該信號(hào)通路與骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展密切相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與本身特性有關(guān)，還受其所在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的影響[25]。TME由基質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)、ECM成分(如炎性細(xì)胞因子、趨化因子等)和外泌體(載有小分子的細(xì)胞外囊泡)等構(gòu)成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[26]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，基質(zhì)細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，即M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)血管生成、基質(zhì)重塑[27]，并與骨肉瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞是骨肉瘤中最主要的浸潤性免疫細(xì)胞，包括未分化的M0型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，而M2型巨噬細(xì)胞在骨肉瘤微環(huán)境中的作用有待進(jìn)一步研究。

本研究通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)鑒定出5個(gè)Hub基因，其中SPP1參與細(xì)胞黏附、局灶黏附和ECM受體相互作用。有文獻(xiàn)報(bào)道溶酶體相關(guān)膜蛋白3(lysosome-associated membrane protein 3，LAMP3)/SPP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能成為預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)[29]，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。EMT是包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要生物過程。MMP在促進(jìn)組織細(xì)胞的再生、調(diào)控細(xì)胞的程序性死亡、促進(jìn)血管生成和其他許多重要組織功能的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用[30]。Yao等[31]報(bào)道LINC01128作為miR- 299- 3p的海綿起調(diào)控作用，促進(jìn)MMP2的表達(dá)并激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展。近年來，LOX也被證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Murdocca等[32]報(bào)道LOX在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中能夠促進(jìn)新生血管生成和EMT形成。

綜上，本研究通過生物信息分析篩選與骨肉瘤相關(guān)的DEGs及Hub基因，并發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中重要的免疫浸潤細(xì)胞，這些結(jié)果可能為骨肉瘤的治療提供新的視角。