陸蓉丹，黃 哲，陸佳敏，張海強，邵永富

寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科 2急診科 3胃腸外科，浙江寧波 315020

胃癌是最常見惡性腫瘤之一，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[1]，其中東亞國家發(fā)病率約占一半，死亡率高于其他地區(qū)國家[2-3]。大多數(shù)胃癌患者被確診時往往已處于晚期，伴有遠處轉(zhuǎn)移，預后不良，5年生存率僅為20%～30%[4- 5]。而早期胃癌若能及時發(fā)現(xiàn)治療，其5年生存率可達90%[6]。胃癌的發(fā)生發(fā)展受多因素的影響[7]，但其確切病因機制尚不清楚，極大程度限制了對其的進一步治療。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類5’端和3’端共價結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[8- 9]，其具有表達豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、進化保守、競爭內(nèi)源性等特點，成為RNA領(lǐng)域的研究熱點[10- 16]。CircRNA在細胞生物學中通過發(fā)揮多種重要作用，如在細胞中作為微小RNA(microRNA，miRNA)的分子海綿、RNA結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)翻譯模板和免疫調(diào)節(jié)器等[17- 18]，參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，circRNA可在組織、血液、尿液和唾液中穩(wěn)定表達，使其在臨床上具有成為生物標志物的巨大潛力[18]。因此，尋找胃癌相關(guān)特異性circRNA分子，探究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的機制具有重大意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0067582只在胃癌組織中，尤其是早期胃癌組織中呈現(xiàn)顯著性低表達，顯示出良好的胃癌組織特異性[19]。hsa_circ_0067582(chr3：141231004- 141259451)是由RAS p21蛋白激活因子2(RAS p21 protein activator 2，RASA2)基因轉(zhuǎn)錄本中第2～5外顯子通過反向剪接環(huán)化形成的，全長394 nt。但目前尚不清楚hsa_circ_0067582對胃癌細胞的調(diào)控作用及潛在機制。因此，本研究擬進一步探究hsa_circ_0067582對胃癌細胞增殖、侵襲能力的重要調(diào)控作用及其關(guān)鍵分子機制，以期為胃癌的治療提供新思路。

材料和方法

材料人胃癌細胞系A(chǔ)GS、SGC- 7901購自上海中國科學院細胞庫。6周齡雄性BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017- 0015，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心，動物使用許可證號為SYXK(浙)2020- 0024。胎牛血清(批號42Q1782K)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號31870082)和Ham’s F- 12K培養(yǎng)基(批號21127022)購自美國Gibco公司；CCK- 8試劑盒(貨號C0037)、RIPA裂解液(貨號P0013K)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012)、BeyoClickTMEdU- 555細胞增殖檢測試劑盒(貨號C0075S)、ECL顯色試劑盒(貨號P0018FS)、Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號4136994)均購自美國BD公司；Trizol試劑(貨號15596026)購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(貨號RR036A)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(貨號RR820A)購自日本TaKaRa公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)3(貨號ab2302)、Caspase 7(貨號ab255818)、Caspase 9(貨號ab32539)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(貨號ab235682)、波形蛋白(Vimentin)(貨號ab137321)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)(貨號ab76011)、GAPDH(貨號ab8245)均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG抗體(貨號1531671)購自美國 Life Technologies公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體(貨號ab1501115)購自美國Abcam公司；hsa_circ_0067582過表達(Oe-circ_0067582)質(zhì)粒及其陰性對照均購自吉瑪基因(上海)股份有限公司；Lipofectamine 2000(貨號11668019)購自美國Invitrogen公司。

細胞培養(yǎng)人胃癌細胞株AGS及SGC- 7901分別使用含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的F- 12K培養(yǎng)基及RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞融合度達80%時進行細胞傳代。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測檢測AGS及SGC- 7901細胞中hsa_circ_0067582的表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參進行相對定量：采用Trizol法提取細胞總RNA，用分光光度計檢測RNA濃度，當A260/A280值介于1.8～2.0間時可進一步行RNA反轉(zhuǎn)錄。采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行hsa_circ_0067582反轉(zhuǎn)錄。運用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒在CFX96實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)完成qRT-PCR擴增，采用2-ΔΔCt法計算hsa_circ_0067582相對表達量，每個樣品設(shè)置3個復孔，實驗重復3次。引物序列：hsa_circ_0067582上游引物：5’-CACAGT-GGCAAAGAAACTTGGT- 3’，下游引物：5’-TGTGGGGT-CCAAGATATGGC- 3’；GAPDH上游引物：5’-ACCCAC-TCCTCCACCTTTGAC- 3’，下游引物：5’-TGTTGCTGTA-GCCAAATTCGTT- 3’。

細胞轉(zhuǎn)染將hsa_circ_0067582全長編碼序列克隆到pLO-ciR載體中，以空白pLO-ciR載體作為陰性對照。將AGS及SGC- 7901細胞接種于6孔板(1×105個/孔)，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合度達60%時，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書的操作步驟，將含Oe-circ_0067582質(zhì)粒及pLO-ciR載體的無血清培養(yǎng)基分組加入到6孔板中。轉(zhuǎn)染細胞48 h后，收集細胞并進行qRT-PCR檢測質(zhì)粒的過表達效率。

CCK- 8法檢測細胞活力將轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒的AGS及SGC- 7901細胞以5×103個/孔均勻鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入10 μl CCK- 8溶液混勻，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，用酶標儀測定各孔細胞在450 nm處的吸光度值，每組設(shè)置6個復孔。

克隆形成實驗收集轉(zhuǎn)染后的各組AGS及SGC- 7901細胞，以5×102個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)箱中孵育，每3 d更換1次培養(yǎng)液，14 d后肉眼可見細胞克隆形成，吸棄培養(yǎng)液，加入PBS洗滌3次，加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，純凈滅菌水洗滌，觀察細胞克隆形成數(shù)。

EdU實驗檢測細胞增殖接種至24孔板的AGS及SGC- 7901細胞轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，2 mg/ml甘氨酸脫色搖床溫育5 min，0.5% TritonX- 100脫色搖床溫育10 min，根據(jù)BeyoClickTMEdU- 555試劑盒說明書對細胞進行Apollo染色及DAPI染色，經(jīng)抗熒光淬滅劑封片后置于熒光倒置顯微鏡下拍照。

Transwell實驗檢測細胞侵襲AGS及SGC- 7901細胞分別轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒和空白pLO-ciR載體，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶常規(guī)消化后收集細胞，PBS清洗后用無血清培養(yǎng)基重懸制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，接種到鋪有基質(zhì)膠并用無血清培養(yǎng)基水化基底膜后的Transwell小室內(nèi)，每孔加入100 μl單細胞懸液，下室內(nèi)每孔加入600 μl含有20% FBS條件培養(yǎng)基。置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育48 h后，取出Transwell小室并用PBS清洗1遍，4%多聚甲醛固定15 min、結(jié)晶紫染色10 min后用PBS清洗2遍，棉球擦去小室基底膜上方表面的細胞后，顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計穿過小孔的細胞數(shù)量。

流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡將轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒和空白pLO-ciR載體的AGS及SGC- 7901細胞培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的胰酶消化細胞后，加入培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，PBS清洗2遍，收集細胞調(diào)整為1×109個/ml細胞懸液，每個Falcon試管中加入100 μl細胞懸液，再加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min后，加入結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

Western blot檢測凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白的表達收集轉(zhuǎn)染48 h后AGS及SGC- 7901細胞，采用RIPA裂解液試劑盒提取總蛋白，并通過BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白質(zhì)濃度。取相同蛋白上樣量，10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，恒流350 mA濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗后，分別加入一抗：Caspase 3(1∶2000)、Caspase 7(1∶1000)、Caspase 9(1∶1000)、E-cadherin(1∶2000)、Vimentin(1∶2000)、N-cadherin(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。隨后加入二抗室溫孵育2 h。采用化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集成像，利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

異種移植瘤實驗6只裸鼠采用隨機數(shù)字法分為Oe-circ_0067582組和pLO-ciR組，每組3只。分別將轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒和空白pLO-ciR載體的SGC- 7901細胞用無血清培養(yǎng)基制備成單細胞懸液，以5×106個(100 μl)濃度注射于裸鼠左腋下皮內(nèi)。每天觀察裸鼠一般狀況及腫瘤生長情況，每5 d用游標卡尺測量1次腫瘤的長徑與短徑，并記錄下相關(guān)數(shù)據(jù)，繪制腫瘤生長曲線，觀察至第30 d，處死荷瘤小鼠，取皮下瘤稱重并拍照。

競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能富集分析通過TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)和miRnada(http：//www.microrna.org/)數(shù)據(jù)庫預測可能與hsa_circ_0067582相互作用的miRNA，構(gòu)建hsa_circ_0067582-miRNA關(guān)系對。利用Tarbase(https：//www.tarbase.com/)數(shù)據(jù)庫預測miRNA的下游靶點，構(gòu)建miRNA-mRNA的調(diào)控關(guān)系。整合hsa_circ_0067582-miRNA及miRNA-mRNA關(guān)系對構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行可視化。進一步使用DIANA-miRPath軟件(http：//snf- 515788.vm.okeanos.grnet.gr/)對miRNA靶基因進行GO和KEGG信號通路分析，探索靶基因行使的生物學功能。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

過表達hsa_circ_0067582對AGS及SGC- 7901細胞活力及增殖能力的影響與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS(17.28±1.24比1.08±0.24；t=7.986，P=0.003)及SGC- 7901細胞(12.47±1.15比1.04±0.35；t=5.581，P=0.008)中的hsa_circ_0067582表達水平均顯著升高。與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS細胞在轉(zhuǎn)染過表達hsa_circ_0067582質(zhì)粒48 h(0.61±0.13比0.86±0.14；t=3.765，P=0.030)；72 h(0.85±0.16比1.25±0.18；t=5.356，P=0.016)和96 h(1.05±0.14比1.76±0.21；t=7.883，P=0.001)的細胞活力顯著降低；SGC- 7901細胞在轉(zhuǎn)染72 h(0.82±0.12比1.15±0.18；t=4.584，P=0.010)和96 h(1.16±0.18比1.72±0.25；t=5.679，P=0.005)的細胞活力顯著降低(圖1A)。細胞克隆形成及EdU染色實驗結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組AGS細胞(15.33±2.51比37.66±4.72；t=6.709，P=0.003)及SGC- 7901細胞(22.41±3.05比53.42±6.50；t=5.857，P=0.003)克隆形成數(shù)目顯著降低(圖1B)，且AGS(35.60±3.49比60.00±5.89；t=4.528，P=0.01)及SGC- 7901(28.48±5.27比71.60±7.54；t=9.847，P=0.001)的細胞DNA復制活性明顯降低(圖1C)。

過表達hsa_circ_0067582對AGS及SGC- 7901細胞侵襲能力的影響Transwell實驗結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組AGS(72.67±9.29比149.78±16.26；t=7.782，P=0.002)及SGC- 7901細胞(114.35±14.64比184.65±19.50；t=6.342，P=0.003)穿過小室的細胞數(shù)明顯減少(圖2)。

過表達hsa_circ_0067582對AGS及SGC- 7901細胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS[(19.92±1.13)%比(7.82±1.05)%；t=7.225，P<0.001]和SGC-7901[(22.44±1.18)%比(5.67±1.07)%；t=11.509，P=0.001]的細胞凋亡百分比均顯著增加(圖3)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS和SGC- 7901細胞Caspase 3(3.83±0.24比1.00±0.09；t=6.863，P=0.002和4.68±0.27比1.00±0.09；t=7.024，P=0.001)、Caspase 7(1.84±0.22比1.00±0.11；t=3.295，P=0.04和2.44±0.12比1.00±0.10；t=6.008，P=0.004)、Caspase 9(1.40±0.07比1.00±0.06；t=4.408，P=0.012和1.46±0.11比1.00±0.09；t=6.278，P=0.004)和E-cadherin(3.11±0.20比1.00±0.09；t=12.453，P=0.002和4.36±0.22比1.00±0.15；t=10.867，P=0.001)表達水平均顯著升高；而Vimentin(0.28±0.02比1.00±0.09；t=7.242，P=0.002和0.38±0.04比1.00±0.10；t=5.694，P=0.004)、N-cadherin(0.23±0.03比1.00±0.08；t=6.480，P=0.003和0.33±0.04比1.00±0.10；t=7.446，P=0.001)蛋白表達水平明顯降低(圖4)。

過表達hsa_circ_0067582對SGC- 7901細胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組小鼠皮下腫瘤體積從第20 d開始增量緩慢，差異具有統(tǒng)計學意義[(0.41±0.12)cm3比(0.64±0.07)cm3;t=7.862，P=0.002](圖5)。第30 d，Oe-circ_0067582組小鼠皮下腫瘤重量明顯低于pLO-ciR組[(0.48±0.25)g比(1.36±0.13)g;t=3.526，P=0.017]。

與pLO-ciR組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2 Transwell檢測Oe-circ_0067582質(zhì)粒對AGS及SGC- 7901細胞侵襲能力的影響(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 流式細胞術(shù)檢測Oe-circ_0067582質(zhì)粒對AGS和SGC- 7901細胞的影響

ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及功能富集分析通過TargetScan和miRnada數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0067582可通過種子序列與hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p、hsa-miR- 421、hsa-miR- 548d- 3p相匹配(圖6A)。從Tarbase數(shù)據(jù)庫中分別獲取上述miRNA的下游靶點，同時利用Cytoscape軟件構(gòu)建hsa_circ_0067582-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖(圖6B)。采用Venny 2.1軟件構(gòu)建韋恩圖結(jié)果顯示，不同的miRNA連接多個共同的下游靶點(圖6C)。功能富集分析結(jié)果顯示，miRNA的預測靶點參與多樣的生物功能過程，如細胞凋亡負調(diào)控、RNA結(jié)合、基因表達等(圖6D)，并與多種癌癥相關(guān)途徑如蛋白多糖、mRNA監(jiān)測途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、p53信號通路等密切相關(guān)(圖6E)。

Caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；Mr：相對分子質(zhì)量

討 論

CircRNA是一類由1個或1個以上剪接的外顯子或內(nèi)含子反向共價連接構(gòu)成的新型非編碼RNA成員，具有保守性、豐富性和組織特異性等特點，使其可能在某些疾病(如腫瘤)中發(fā)揮特殊的分子標記作用[4，20]。circRNA可通過選擇性剪接、調(diào)控親本基因的表達、充當?shù)鞍踪|(zhì)復合物組裝的支架以及RNA-蛋白相互作用來調(diào)控基因表達，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。

前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0067582與胃癌密切相關(guān)，具有作為預防及診斷胃癌生物標志物的潛能[19]。本研究結(jié)果顯示，hsa_circ_0067582過表達能夠抑制AGS和SGC- 7901細胞的細胞活力、增殖和侵襲能力，并促進AGS和SGC- 7901細胞的凋亡。此外，AGS和SGC- 7901細胞的hsa_circ_0067582過表達伴隨著Caspase 3、Caspase 7和Caspase 9凋亡相關(guān)蛋白表達水平的升高。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞失去極性、經(jīng)過細胞骨架重塑轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間充質(zhì)表型的過程。越來越多的研究表明EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個重要環(huán)節(jié)[21- 22]，促進胃癌細胞的侵襲及遷移能力[22]，其主要的特征為Vimentin表達增加和E-cadherin表達減少等。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0067582過表達顯著提高AGS和SGC- 7901細胞E-cadherin的表達水平，且明顯降低Vimentin及N-cadherin的表達水平，提示hsa_circ_0067582過表達可能通過抑制EMT進程從而抑制AGS和SGC- 7901細胞的侵襲能力。同時，過表達hsa_circ_0067582的SGC- 7901細胞在裸鼠皮下移植瘤生長過程中速度有所放緩。上述結(jié)果提示hsa_circ_0067582在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，hsa_circ_0067582有希望成為新的胃癌治療靶點。

與pLO-ciR組比較，aP<0.05，bP<0.01

A.TargetScan和miRnada數(shù)據(jù)庫預測hsa_circ_0067582相互作用的微小RNA；B.hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p、hsa-miR- 421和hsa-miR- 548d- 3p靶基因的韋恩圖；C.hsa_circ_0067582-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，紅色六邊形代表hsa_circ_0067582，綠色棱形代表miRNA，藍色矩形代表miRNA靶基因，黃色矩形代表miRNA共同調(diào)控的靶基因；D.靶基因GO功能富集圖；E.靶基因KEGG功能富集圖

研究表明，circRNA可以直接或者間接在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。CircRNA可通過作為miRNA海綿或ceRNA的方式發(fā)揮作用[9，18，23- 24]。通過TargetScan和miRnada數(shù)據(jù)庫預測可知，hsa_circ_0067582可能競爭性結(jié)合多個miRNA，分別為hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p、hsa-miR- 421和hsa-miR- 548d- 3p。有文獻報道hsa-miR- 421與胃癌密切相關(guān)。Chen等[25]研究結(jié)果表明血漿中hsa-miR- 421的表達水平升高可以明顯區(qū)分正常人群、胃癌早期及胃癌病例，特別是在胃癌早期。然而，hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p和hsa-miR- 548d- 3p在胃癌中未見報道，值得進一步研究其與hsa_circ_0067582的相互作用。通過對miRNA靶基因進行功能富集分析發(fā)現(xiàn),靶基因顯著富集到細胞凋亡負調(diào)控、RNA結(jié)合、基因表達、mRNA監(jiān)測途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、TGF-β、p53信號通路等。其中，大部分通路已有文獻支持與腫瘤發(fā)生機制密切相關(guān)，如TGF-β信號通路介導胃癌細胞EMT而促進胃癌細胞遷移、侵襲的能力[26]。以上結(jié)果提示，hsa_circ_0067582介導的ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與了胃癌發(fā)生發(fā)展的多個生物學過程。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達hsa_circ_0067582可以顯著抑制AGS和SGC- 7901細胞的增殖及侵襲能力，并促進細胞凋亡。本研究進一步揭示了hsa_circ_0067582在胃癌中的作用及其發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機制，為探究胃癌防治新靶點提供新方向。