王家興，申文鳳，肖 瑞，馮學(xué)敏，馬睿婷，王澤鋒，任建軍

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1肝膽外科 2超聲科 3分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 5影像診斷科，呼和浩特 010050

膽管癌作為一種起源于膽管黏膜上皮細(xì)胞、惡性程度很高的消化道腫瘤，根據(jù)其發(fā)生位置，一般分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)，后者又分為肝門(mén)部膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌，總體占膽管癌發(fā)生率的80%以上[1]。盡管ECC在外科手術(shù)、化療以及放療方面取得了進(jìn)展，但罹患該疾病患者的5年生存率仍低于35%[2]。ECC早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于晚期，因此無(wú)法切除腫瘤的患者的平均生存期通常不到12個(gè)月[3]。目前該疾病具體機(jī)制不明且缺乏有效、特異性較好的腫瘤標(biāo)志物[4]，因此探索潛在的腫瘤分子標(biāo)志物對(duì)于ECC的診斷有著極為重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在功能上被定義為長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼功能。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中在lncRNA的功能和作用機(jī)制方面。有研究表明lncRNA幾乎在基因表達(dá)的每個(gè)階段都發(fā)揮了廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平[5]。此外，大量證據(jù)顯示，lncRNA通過(guò)各種調(diào)節(jié)途徑在癌癥發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[6]。lncRNA H19作為第1個(gè)印記基因被發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)海綿化miR-let- 7a和miR- 372的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA模式靶向白細(xì)胞介素- 6和CXC 趨化因子受體 4，從而調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并被認(rèn)為可能是CCA發(fā)生發(fā)展的原因之一[7]。癌癥易感候選基因2(cancer susceptibility candidate 2，CASC2)位于10q26的一個(gè)基因組區(qū)域中，該區(qū)域通常在人類子宮內(nèi)膜癌中丟失，也因此最初在子宮內(nèi)膜癌中被鑒定為抑癌基因[8]。越來(lái)越多的研究逐漸揭示了兩者在消化道腫瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中潛在的功能與影響，但目前在ECC中的具體作用機(jī)制尚不完全明確。本研究旨在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及相關(guān)實(shí)驗(yàn)探討ECC中l(wèi)ncRNA CASC2和H19的表達(dá)及其潛在的功能作用。

對(duì)象和方法

對(duì)象采用前瞻性隊(duì)列研究，選取2017年9月至2020年7月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除的26例ECC患者作為研究對(duì)象，其中男性患者15例，女性患者11例，年齡范圍為47～78歲，中位年齡64.5歲。術(shù)中留取新鮮 ECC 組織，同時(shí)獲取距腫瘤邊界至少2 cm區(qū)域的癌旁組織，標(biāo)本剪切成小塊，厚度不超過(guò)0.5 cm。取材后迅速移入凍存管并放置液氮中冷凍保存。期間排除無(wú)法配合研究、術(shù)前接受放療或化療的病例。本研究通過(guò)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)生物倫理審批(倫理審批編號(hào)：YKD2019068)，所有患者均在手術(shù)前簽署知情同意書(shū)。

臨床指標(biāo)和分組收集患者臨床數(shù)據(jù)，包括患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤TNM分期、腫瘤標(biāo)志物(CA199、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA125)和病理結(jié)果(分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、神經(jīng)侵犯)等，具體數(shù)值和定性結(jié)果參考由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院出具的正式檢驗(yàn)和術(shù)后病理切片報(bào)告為準(zhǔn)。按照目的基因表達(dá)量的平均值進(jìn)行分組，高于均值的為高表達(dá)組，反之為低表達(dá)組。

建庫(kù)測(cè)序和功能富集分析分別對(duì)4例ECC癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，比較兩組間的差異并繪制表達(dá)圖譜。此部分委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。將整理后的轉(zhuǎn)錄本與基因本體(gene ontology，GO)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，此方法基于Wallenius非中心超幾何分布[9]，P<0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO條目。京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[10]通路富集分析使用 KOBAS 2.0工具[11]，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.05的通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路，并進(jìn)行匯總制圖。

細(xì)胞培養(yǎng)4種不同分化程度的膽管癌細(xì)胞株(RBE、QBC939、HuH- 28、HuCCT1)和正常膽管上皮細(xì)胞株(HIBEC)(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)使用含10%胎牛血清和1%雙抗(l00 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

RNA提取樣本組織在液氮中快速研磨，加入組織裂解液勻漿后室溫放置，離心取上清液移入無(wú)酶離心管。提取步驟參考RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用超微量分光光度計(jì)校準(zhǔn)后加樣，使用Nucleic Acid系統(tǒng)分析樣本的RNA液濃度并記錄。測(cè)量后RNA液于-80 ℃冰箱保存。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞提取總RNA，操作步驟同前。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)qRT-PCR分別測(cè)定組織樣本和細(xì)胞中的lncRNA CASC2及H19的表達(dá)。依據(jù)qRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)說(shuō)明，取2 μl RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min →85 ℃ 5 min 。產(chǎn)物擴(kuò)增使用ABI7500熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s，1 個(gè)循環(huán)，采集熒光。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用ΔΔCt相對(duì)定量法分析結(jié)果，差異水平用2-ΔΔCt表示。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：CASC2上游引物5’-CCCGTGTCTTTACTGAGTCCC- 3’，下游引物5’-TCTCTAGTGCCATACGGGGT- 3’；H19上游引物5’-CA GGAGTGATGACGGGTGGA- 3’，下游引物5’-TGCCACG TCCTGTAACCAAAA- 3’；GAPDH上游引物5’-CTGAACG GGAGCTCACTGG- 3’，下游引物 5’-TCCGATGCCTGCT TCACTAC- 3’。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M(Q1，Q3)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以絕對(duì)數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

測(cè)序分析4對(duì)ECC癌組織與癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，lncRNA CASC2在ECC癌組織中被上調(diào)，而lncRNA H19在癌組織中被下調(diào)(圖1A)，其中以轉(zhuǎn)錄本ENST00000454781.5(Z=0.000，P=0.029)和ENST00000414790.6(Z=16.000，P=0.029)最為典型。對(duì)上述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)錄本ENST00000454781.5在所有癌組織中均呈高表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄本ENST00000414790.6在所有癌組織中均呈低表達(dá)，同時(shí)所有癌組織樣本聚集在一起，與相鄰的癌旁組織樣本存在差別(圖1B)。通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)法分別對(duì)lncRNA CASC2和H19與其靶基因進(jìn)行相關(guān)性分析，其中黏連蛋白復(fù)合成分RAD21、Ras癌基因家族成員RAB8B和外泌體成分5與CASC2關(guān)系最為密切(r=0.976，r=-0.966,r=0.953，P均<0.001)；而磷酸二酯酶4D相互作用蛋白、WASP家族成員3和連接素激素與H19關(guān)系最為密切(r=0.961,r=0.970,r=-0.954，P均<0.001)。

功能富集分析將整理后的轉(zhuǎn)錄本與GO和KEGG公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比結(jié)果顯示，lncRNA CASC2出沒(méi)于細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)部分(χ2=20.023,χ2=18.523，P均<0.001)，參與單一生物代謝過(guò)程中絲氨酸家族氨基酸代謝過(guò)程(χ2=16.609，P<0.001)，主要是發(fā)揮催化活性的功能(χ2=31.551，P<0.001)。通路分析結(jié)果顯示：代謝途徑(hsa01100)(t=-141.458，P<0.001)、糖鞘脂的生物合成-乳酸和新乳酸酯系列(hsa00601)(t=-25.720，P=0.001)、藥物代謝-細(xì)胞色素P450(hsa00982)(t=-14.709，P=0.005)相對(duì)影響因子較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。

lncRNA H19出沒(méi)于細(xì)胞膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞投射和突觸后部分(χ2=16.706，χ2=19.003，χ2=15.335，χ2=12.229，χ2=11.685，P均<0.001)，影響系統(tǒng)開(kāi)發(fā)、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生、催化活性的調(diào)節(jié)和分子功能的正調(diào)控(χ2=19.748，χ2=19.107，χ2=10.331，χ2=21.364，P均<0.001)，主要是發(fā)揮了蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞骨架蛋白-β微管蛋白、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞黏附分子-鈣黏蛋白)結(jié)合(χ2=13.216，P<0.001)、酰胺結(jié)合(χ2=10.678，P<0.001)、激素結(jié)合(χ2=17.579，P<0.001)、鈣離子結(jié)合(χ2=7.647，P=0.004)與轉(zhuǎn)錄激活子活性RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合的功能(χ2=10.322，P=0.001)以及酶激活劑活性(χ2=7.481，P=0.011)的作用。通路分析結(jié)果中可卡因成癮(hsa05030)(t=-22.664，P=0.001)、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor- 1，HIF- 1)信號(hào)通路(hsa04066)(t=-11.810，P=0.007)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(hsa04660)(t=-7.581，P=0.019)相對(duì)影響因子較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。

相對(duì)表達(dá)量分析22對(duì)ECC癌組織與癌旁組織qRT-PCR結(jié)果顯示，lncRNA CASC2在ECC癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(1.943±2.562比1.024±0.045；t=1.262，P=0.025)(圖3A)；lncRNA H19在ECC癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(2.839±2.524比3.985±3.156；t=1.285，P=0.005)(圖3B)。不同分化程度的膽管癌細(xì)胞qRT-PCR結(jié)果顯示，QBC939和HuH- 28細(xì)胞中CASC2的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(t=8.114，P=0.015；t=9.202，P=0.012)(圖3C)；而RBE、QBC939、HuH- 28和HuCCT1細(xì)胞中H19的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(t=-10.244，P< 0.001；t=-10.476，P< 0.001；t=-19.798，P< 0.001；t=-16.193，P=0.004)(圖3D)。

CASC2：癌癥易感性候選物2；lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA

臨床指標(biāo)相關(guān)性分析lncRNA CASC2和H19不同表達(dá)組臨床指標(biāo)的比較結(jié)果顯示，lncRNA CASC2表達(dá)水平與病理中分化(χ2=6.222，P=0.022)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.455，P=0.020)顯著相關(guān)；而lncRNA H19表達(dá)水平與病理中分化(χ2=1.174，P=0.029)、腫物大小(χ2=-0.507，P=0.037)顯著相關(guān)。其余臨床指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

討 論

目前國(guó)內(nèi)外研究普遍認(rèn)為lncRNA CASC2在肝癌、胰腺癌、胃癌等消化道腫瘤中呈低表達(dá)趨勢(shì)。例如肝癌組織及細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA CASC2呈低表達(dá)并通過(guò)CASC2/miR- 367/F框/WD- 40域蛋白7(F-box and WD- 40 domain protein 7，F(xiàn)BXW7)軸調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)行為[12]。miR- 367作為肝癌lncRNA CASC2的作用靶點(diǎn)，對(duì)FBXW7直接產(chǎn)生調(diào)控作用，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。lncRNA CASC2還可通過(guò)CASC2/miR- 24- 3p/SRY-box轉(zhuǎn)錄因子7、CASC2/miR- 222、CASC2/miR- 362- 5p/核轉(zhuǎn)錄因子-κB、CASC2/絲裂原活化蛋白激酶、CASC2/miR- 24/miR- 221、CASC2/第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信號(hào)通路參與肝癌的進(jìn)展[13- 18]。胰腺癌中l(wèi)ncRNA CASC2的低表達(dá)可能通過(guò)CASC2/miR-21/PTEN、CASC2/miR-24/黏糖蛋白6、CASC2/PTEN等信號(hào)通路發(fā)揮功能[19- 21]。當(dāng)lncRNA CASC2過(guò)表達(dá)時(shí)，PTEN表達(dá)升高，而p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR則下調(diào)[22]。胃癌中l(wèi)ncRNA CASC2呈低表達(dá)，且與轉(zhuǎn)錄因子E2F6和lncRNA CASC2呈明顯的負(fù)相關(guān)，E2F6可反向調(diào)控lncRNA CASC2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[23]。本研究通過(guò)RNA-seq相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)合PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，lncRNA CASC2在ECC腫瘤組織中呈上調(diào)趨勢(shì)，與以往報(bào)道的lncRNA CASC2在其他消化道腫瘤中的普遍下調(diào)截然相反。同時(shí)臨床指標(biāo)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種高表達(dá)與轉(zhuǎn)移、病理分化相關(guān)，提示lncRNA CASC2可能通過(guò)尚未揭示的調(diào)控機(jī)制促進(jìn)疾病的進(jìn)展。lncRNA CASC2具有作為一個(gè)新興的、潛在的ECC分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究潛力。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在一些腫瘤中起致癌基因[24- 25]作用，而在一些腫瘤中又可以充當(dāng)抑癌基因[26]發(fā)揮生物學(xué)功能。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道在CCA組織樣本和細(xì)胞系中H19呈上調(diào)趨勢(shì)，且這種上調(diào)與CCA患者的腫瘤大小、TNM分期、術(shù)后復(fù)發(fā)和總體生存率相關(guān)[27]。這與本研究結(jié)果存在差異，其原因可能與研究對(duì)象為ECC有關(guān)。Han等[28]發(fā)現(xiàn)lncRNA H19有著區(qū)分CCA組織和正常組織的特征，表明特異lncRNA可能具有檢測(cè)CCA的潛力，并通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)、肝外膽管癌之間和分化好與分化差的組織之間的lncRNA表達(dá)水平存在不同，提示肝外與肝內(nèi)膽管癌之間潛在的調(diào)控機(jī)制可能有所差異，還需要更多的病例來(lái)支持本研究結(jié)論。

A.lncRNA CASC2通路分析結(jié)果顯示CASC2與代謝途徑、糖鞘脂的生物合成-乳酸和新乳酸酯系列、藥物代謝-細(xì)胞色素P450關(guān)系更為密切；B.lncRNA H19通路分析結(jié)果顯示H19與可卡因成癮、HIF- 1信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路關(guān)系更為密切

與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

ECC的疾病具體機(jī)制目前尚不明確，對(duì)于其相關(guān)lncRNA的功能理解還處于初級(jí)階段。由于lncRNA能以RNA形式在轉(zhuǎn)錄及之后的多種層面調(diào)控基因表達(dá)[29]，因此可以通過(guò)mRNA的生物學(xué)功能來(lái)間接推測(cè)其共表達(dá)lncRNA可能具備的某些功能，從而有助于進(jìn)一步理解其相關(guān)分子機(jī)制[30]。本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，lncRNA CASC2靶基因主要參與代謝過(guò)程，發(fā)揮催化活性的功能。通路富集結(jié)果中糖鞘脂在調(diào)控細(xì)胞識(shí)別、黏附、增殖以及凋亡等方面均有重要的生物學(xué)作用；細(xì)胞色素P450在前致癌物和抗癌物質(zhì)的代謝活化和清除中發(fā)揮著重要作用。lncRNA H19靶基因主要影響生物發(fā)展過(guò)程，參與蛋白質(zhì)、酰胺、激素、鈣離子等多種物質(zhì)的結(jié)合并有著調(diào)節(jié)酶激活劑活性的作用。通路分析結(jié)果中HIF- 1信號(hào)通路的活性主要由HIF-α亞基決定，是缺氧信號(hào)的主要調(diào)節(jié)因子，研究其作用機(jī)制有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；T細(xì)胞受體信號(hào)通路的激活可以抵抗腫瘤細(xì)胞和致病體對(duì)機(jī)體的侵襲，可見(jiàn)兩者作為腫瘤治療的靶標(biāo)具有很好的應(yīng)用前景。

表1 lncRNA CASC2和H19不同表達(dá)組臨床指標(biāo)的比較

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECC中l(wèi)ncRNA CASC2和H19出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄失調(diào)，lncRNA CASC2在癌細(xì)胞中被上調(diào)，而lncRNA H19則相反。兩者均有成為ECC新的分子標(biāo)志物的潛力，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步挖掘。