劉黎嘉琪 徐靜 范勝諾 楊仟 伍少玲 馬超

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是一種臨床上常見的外 傷性疾病，它不僅會給患者帶來運(yùn)動(dòng)、言語功能障礙，還會使患者產(chǎn)生認(rèn)知障礙［1，2］。研究表明，TBI病史會提高人群患阿爾茲海默?。ˋD）、帕金森綜合征等癡呆疾病的風(fēng)險(xiǎn)，也增加delta 裂解酶（AEP）加速APP 的裂解，促進(jìn)β-淀粉樣蛋白（Aβ）的產(chǎn)生［3，4］。這表示TBI 可能會使大腦AD 相關(guān)病理進(jìn)展加快，并最終導(dǎo)致認(rèn)知損害。在臨床康復(fù)中，雖然有深部腦刺激、迷走神經(jīng)電刺激等用于TBI 后的治療［5，6］，但對TBI 所產(chǎn)生的認(rèn)知障礙，仍然缺少安全有效的干預(yù)手段。三叉神經(jīng)電刺激（TNS）對抑郁癥、癲癇、意識障礙等疾病有改善作用［7-9］。TNS 可以引起交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)的協(xié)同作用，產(chǎn)生交感神經(jīng)介導(dǎo)的系統(tǒng)血壓低頻振蕩模式，減輕全身炎癥，改善失血性休克的結(jié)局［10］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，TNS 可以顯著激活下丘腦外側(cè)核和三叉神經(jīng)脊核的神經(jīng)元活動(dòng)，提高昏迷大鼠的腦電信號，促進(jìn)意識恢復(fù)，TNS 還可以促進(jìn)海馬區(qū)細(xì)胞增殖，并激活孤束核、藍(lán)斑等腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)［11］。本研究采用TNS 治療TBI 后小鼠的認(rèn)知障礙，并探討其可能的機(jī)制，為TBI 后的認(rèn)知障礙患者提供新的治療方案。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級C57BL/6J 小鼠60 只，周齡8-12 w，體重（26±3）g，均購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號碼SCXK（粵）2016-0029］。實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠以每籠5-6 只飼養(yǎng)于溫度恒定，保持12 h 晝夜循環(huán)的環(huán)境下，并提供充足的水與飼料。所有操作均符合中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)章制度，經(jīng)由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查小組批準(zhǔn)。

1.2 分組與造模 將60 只小鼠均分為3 組，分別是假手術(shù)組（sham）、腦損傷組（TBI）和電刺激組（TNS）各20 只。參考相關(guān)文獻(xiàn)［12］，在異氟烷氣體麻醉下采用自由落體（Weight-Drop）模型，構(gòu)建小鼠TBI 模型，sham 組只行頭皮切開及縫合操作，各組麻醉時(shí)間保持一致，手術(shù)結(jié)束后放回籠內(nèi)，予保暖至小鼠正常蘇醒。

1.3 儀器與試劑材料 （1）儀器：小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)（R500 通用型，瑞沃德生命科技有限公司）、自由落體撞擊器（瑞沃德生命科技有限公司）、電刺激儀器（A-M System）、Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）、蛋白質(zhì)免疫印跡電泳槽（BIO-RAD）、免疫熒光自動(dòng)掃片儀（Leica）。（2）試劑：抗LC3A/B 抗體（Cell Signaling Technology）、抗Iba1 抗 體（Wako）、抗APP 抗 體（Abcam）、BCA 蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher）。

1.4 三叉神經(jīng)電刺激方案 造模結(jié)束后第1 h 與24 h，在異氟烷氣體麻醉下，于3 組小鼠三叉神經(jīng)V2 支體表處安放電極，進(jìn)行雙側(cè)電刺激，sham 組與TBI 組不通電。刺激參數(shù)：頻率40 Hz；電流0.1mA；30s on，30 soff；持續(xù)30 min。

1.5 行為學(xué)評估 造模結(jié)束后第48 h，參考相關(guān)文獻(xiàn)［13］，對每組各10 只小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮測試。測試共6 天。第1 天行可見平臺訓(xùn)練，設(shè)置一個(gè)可見平臺，將小鼠從各個(gè)象限背對水池放入池中120 s 尋找平臺，使其適應(yīng)環(huán)境并測試其游泳能力，避免因腦損傷造成行動(dòng)受限而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第2-5 天進(jìn)行隱藏平臺測試，將平臺放于SE象限，每天從不同象限將小鼠放入水池中120 s 尋找平臺，若小鼠在120 s 內(nèi)找到平臺則讓其在上面停留15 s，如果超過120 s 小鼠仍未找到平臺，則引導(dǎo)其在平臺上停留15 s。第6 天進(jìn)行探索測試，將平臺拿走，從SW 象限放入小鼠，測試小鼠的空間記憶能力。每天測試均在固定時(shí)間進(jìn)行，測試結(jié)束后小鼠進(jìn)行保暖烘干，放回籠中。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡 造模結(jié)束后48 h，每組各5 只，在異氟烷深度麻醉下斷頭取腦，每只小鼠取海馬，液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存，待所有樣本取材完成后進(jìn)行Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)。將小鼠海馬樣本加入含有蛋白酶抑制劑的強(qiáng)RIPA裂解液，使用自動(dòng)冷凍研磨機(jī)進(jìn)行組織勻漿，提取蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度后使蛋白變性，后進(jìn)行上樣、電泳分離，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，4℃孵育一抗過夜。次日使用TBST 洗滌后室溫孵育二抗1 h，再洗膜進(jìn)行顯影，獲得圖像后使用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 免疫熒光技術(shù) 造模結(jié)束第48 h，經(jīng)心臟灌注生理鹽水與4%多聚甲醛取腦，全腦置于4%多聚甲醛中，在4℃下固定24 h。固定后將樣本浸泡在30%蔗糖溶液中脫水48 h，使用OCT 包埋劑包埋，在冰凍切片機(jī)中進(jìn)行切片，片厚40 μm。切片后使用PBS 洗凈包埋劑，PBST（0.4%Triton X-100）配置10%山羊血清封閉，封閉后使用一抗4℃過夜。次日將標(biāo)本置于室溫2 h 后，使用PBST 洗滌，避光使用對應(yīng)熒光二抗，室溫孵育2 h。PBST 洗滌后以DAPI 染色，后將切片轉(zhuǎn)于載玻片上，并滴加熒光抗淬滅劑，蓋上蓋玻片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 25.0 軟件與Graphpad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與繪圖。數(shù)據(jù)均以（±s）形式體現(xiàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，若方差齊則采用單因素方差分析法，方差不齊采用K-W 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 三組TBI 小鼠的認(rèn)知能力比較 Morris 水迷宮測試中，TBI 組小鼠和TNS 組小鼠之間的平均游泳速度并無差異，首先排除了TBI 有可能導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)功能損傷給認(rèn)知測試帶來的影響。在第6 日的測試中，TNS 組小鼠的平臺穿越次數(shù)與目標(biāo)象限時(shí)間占比兩個(gè)指標(biāo)都明顯優(yōu)于TBI 組小鼠（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Morris 水迷宮測試結(jié)果（注：與TBI 組進(jìn)行比較，*表示P＜0.05）

2.2 三組TBI 后小鼠海馬自噬水平與清除能力比較 TNS 組小鼠的海馬區(qū)LC3 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見圖2。在TNS 組小鼠海馬組織中，Iba1 表達(dá)水平顯著高于TBI 組（P＜0.01），見圖3。

圖2 各組海馬區(qū)LC3 蛋白表達(dá)水平（注：與TBI 組進(jìn)行比較，**表示P＜0.01）

圖3 各組海馬APP 蛋白表達(dá)水平各組小鼠海馬區(qū)Iba1 免疫熒光染色與Western Blot 中Iba1 蛋白表達(dá)水平

2.3 三組TBI后APP水平的比較 在損傷后48 h，APP 的累積較TBI 組明顯減少（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組海馬APP 蛋白表達(dá)水平（注：與TBI 組比較，*表示P＜0.05）

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，TNS 治療可改善TBI 小鼠的空間記憶功能，TNS 顯著改善了TBI 后小鼠大腦的自噬水平，并在急性期激活了更多的小膠質(zhì)細(xì)胞，減輕了Aβ 相關(guān)蛋白的累積，故推測改善認(rèn)知能力的機(jī)制與此相關(guān)。

3.1 損傷后大腦的自噬水平改變 由于溶酶體功能障礙，導(dǎo)致早期自噬底物sequestosome 1 的累積，使自噬水平受到影響，這樣的累積在TBI 后1-3天達(dá)到峰值并最終導(dǎo)致大腦神經(jīng)元的死亡，在TBI后1 天通過抑制PLA2G4A/cPLA2 恢復(fù)自噬水平，能夠逆轉(zhuǎn)TBI 小鼠大腦皮層和海馬的神經(jīng)元死亡情況，并改善小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性［14，15］。這表明自噬水平可作為TBI 后干預(yù)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。外力沖擊大腦造成軸突損傷，并伴隨APP 大量累積在此類受損軸突中，APP 是Aβ 的前體蛋白，這可能是大量研究中TBI 后Aβ 斑塊積聚的原因。有研究使用藥物治療TBI 通過改善自噬水平，減輕了APP 與Aβ 的負(fù)荷，并最終改善了小鼠的認(rèn)知障礙［16］。因此，在TBI 急性期保證自噬功能的正常水平，可減輕TBI 給大腦帶來的不良病理變化，對后續(xù)的功能恢復(fù)有重大意義。本研究觀察到TNS組小鼠海馬組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 水平的增高，并伴隨著APP 水平的下降，說明TNS 對TBI 可以有較顯著的治療效果。

3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞在TBI 中的作用 小膠質(zhì)細(xì)胞是TBI 的第一類反應(yīng)者，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演“哨兵”的角色。在TBI 的急性期，小膠質(zhì)細(xì)胞可以快速將自身分支向受損部位延伸，并向受損部位進(jìn)行定向遷移，限制受損的擴(kuò)散；腦血管旁的小膠質(zhì)細(xì)胞通過嘌呤能受體P2RY12 介導(dǎo)可以在血腦屏障受損時(shí)幫助其修復(fù)閉合，維持大腦血腦屏障［17］。Nagamoto-Combs 等在恒河猴受到TBI 的大腦中發(fā)現(xiàn)，病變部位周圍小膠質(zhì)細(xì)胞還可以表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其對應(yīng)受體，在其長期的恢復(fù)過程中有營養(yǎng)性的作用［18］。在Willis 等的實(shí)驗(yàn)中，TBI 后重新填充增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過白細(xì)胞介素-6 促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生，從而幫助TBI 后認(rèn)知障礙的恢復(fù)［19］。對TBI 后神經(jīng)免疫學(xué)范式轉(zhuǎn)變時(shí)間點(diǎn)總結(jié)的綜述也表明，在TBI 后的急性期，小膠質(zhì)細(xì)胞的增多，有利于TBI 后期的恢復(fù)［20］。而在本研究中，在急性期通過TNS 治療可使小膠質(zhì)細(xì)胞增多，這可能增強(qiáng)了小膠質(zhì)細(xì)胞對受損部位的吞噬、清除以及神經(jīng)保護(hù)能力。

綜上所述，TNS 作為一種安全、有效的治療TBI 的手段，可以提高認(rèn)知能力，其機(jī)制可能與提高TBI 后的自噬水平和小膠質(zhì)細(xì)胞的清除保護(hù)能力，減輕Aβ 相關(guān)蛋白的負(fù)荷相關(guān)。