朱 灝, 張文清, 杜傳元, 朱芳芳, 胡曉松, 劉亞群

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

醛類(lèi)化合物廣泛存在于食物[1-6]、飲料[7-12]、生態(tài)環(huán)境[13-16]和生物系統(tǒng)中[17-22]，它們的含量對(duì)于人體健康和人類(lèi)的生活質(zhì)量有深遠(yuǎn)影響。以食品工業(yè)為例，醛類(lèi)化合物的含量是食品質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的重要指標(biāo)之一。低含量的醛類(lèi)物質(zhì)的存在能提供食品令人愉悅的風(fēng)味，而當(dāng)醛類(lèi)物質(zhì)的含量過(guò)高時(shí)會(huì)加速食品的變質(zhì)?？啡?F)、 5-甲基糠醛(5-MF)、 5-羥甲基糠醛(5-HMF)廣泛存在于各種食品中，其含量是其新鮮度和質(zhì)量的重要指標(biāo)[2,5,10,12]，因此醛類(lèi)物質(zhì)的定量分析和檢測(cè)具有重要的研究意義。目前已經(jīng)有基于紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析、核磁共振分析、氣相色譜分析等醛類(lèi)化合物的檢測(cè)方法[23-27]，但它們受到低選擇性、基質(zhì)效應(yīng)或者復(fù)雜的前處理等多方面的限制?；谥盁晒庋苌母咝б合嗌V分析法是目前理想的醛類(lèi)化合物檢測(cè)手段，熒光衍生可以增強(qiáng)被分析物的疏水性和光譜響應(yīng)。解決了大部分醛類(lèi)化合物由于缺少發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)帶來(lái)的檢測(cè)上的困難。

香豆素結(jié)構(gòu)廣泛存在于自然界的許多植物中[28-29]，因其具有體積小、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大，容易合成與修飾等優(yōu)點(diǎn)，常被應(yīng)用于熒光探針的設(shè)計(jì)與合成中[30-40]。含香豆素?zé)晒鈭F(tuán)的衍生試劑已經(jīng)在醛類(lèi)化合物的定量分析中得到了廣泛的應(yīng)用[34-40]。熒光衍生試劑除了需要具備良好的熒光團(tuán)以外，其分子結(jié)構(gòu)中還必須具備可以在溫和條件下快速與被分析物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的基團(tuán)。由于羥胺能與醛類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行硝酮化或者肟化反應(yīng)的特征，含羥胺結(jié)構(gòu)的化合物也被應(yīng)用于常見(jiàn)醛類(lèi)物質(zhì)和糖類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)中[38-40]。羥胺結(jié)構(gòu)在有機(jī)化學(xué)中十分重要，被應(yīng)用于許多經(jīng)典的有機(jī)反應(yīng)之中[41-44]。傳統(tǒng)的N-取代羥胺化合物的合成方法仍是依靠拉西合成，電解還原，肟化水解等傳統(tǒng)工藝[38,45-47]。這些方法普遍存在能耗大，所需設(shè)備多，工藝流程長(zhǎng)，反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題，因而復(fù)雜的羥胺化合物難以得到廣泛的合成與應(yīng)用。Rinske等在2013年提出了一種新的合成方案[48]，將鹵代烴與N，O-雙叔丁氧羰基(Boc)羥胺進(jìn)行反應(yīng)，得到的產(chǎn)物再通過(guò)鹽酸水解，就可以得到N-羥胺鹽酸鹽。該種方法條件溫和，原料易得，副產(chǎn)物較少，適合于設(shè)計(jì)合成較為復(fù)雜的N-羥胺衍生物。

Taran課題組發(fā)現(xiàn)[49]，悉尼酮(又稱(chēng)斯德酮)這種特殊的介離子化合物可以與炔烴進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，形成帶有吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。該反應(yīng)相比于傳統(tǒng)的Husigen環(huán)加成反應(yīng)具有許多明顯的優(yōu)勢(shì)：可以避免使用較為危險(xiǎn)的疊氮化合物，同時(shí)悉尼酮的反應(yīng)活性更高，反應(yīng)速率更快。除此之外，原本的香豆素-悉尼酮衍生物幾乎沒(méi)有熒光，但與炔烴進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)之后得到的吡唑香豆素產(chǎn)物的熒光性能優(yōu)異[49]。因此，該類(lèi)反應(yīng)近年來(lái)多應(yīng)用于細(xì)胞成像等領(lǐng)域[49-52]。

以這些工作為基礎(chǔ),本課題組設(shè)計(jì)并合成了兩種含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的羥胺類(lèi)熒光探針10和11(Scheme 1和Scheme 2)：先根據(jù)文獻(xiàn)中的方法[52]，以4-甲氧基水楊醛和N-乙酰甘氨酸為原料，合成了3-氨基-7-甲氧基香豆素3，3與溴乙酸進(jìn)行取代反應(yīng)，得到香豆素羧酸中間體4,4與亞硝酸叔丁酯和三氟乙酸酐反應(yīng)，生成香豆素-悉尼酮結(jié)構(gòu)的母體化合物5。含炔基的化合物6和化合物7由溴丙炔和含Boc結(jié)構(gòu)的羥胺反應(yīng)制備[48]，再與悉尼酮進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，得到含有香豆素吡唑結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物化合物8和化合物9，最后用鹽酸脫去Boc保護(hù)基生成目標(biāo)產(chǎn)物10和11。相關(guān)的應(yīng)用研究以N-取代羥胺為例，與糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛進(jìn)行了熒光衍生，通過(guò)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)以及HR-MS(高分辨質(zhì)譜)進(jìn)行表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀；Thermo fisher Q-Exactive型質(zhì)譜儀；Nicolet iS5型紅外光譜儀 (KBr 壓片)；LS55型熒光分光光度計(jì)；Bruker AVANCE III 500 MHz NMR型核磁共振儀(氘代二甲亞砜和氘代氯仿為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))。

所用試劑均為分析純或化學(xué)純；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏桶裝蒸餾水；衍生分析部分涉及到的溶劑均為色譜純。

Scheme 1

Scheme 2

1.2 合成

(1) 化合物3的合成

將二環(huán)己基碳二亞胺(2.48 g, 12.0 mM)和N-乙酰甘氨酸(2.81 g, 24.0 mM)加入至二氯甲烷(40 mL)中攪拌過(guò)夜。過(guò)濾掉生成的固體并用二氯甲烷(30 mL)沖洗濾渣。合并濾液和洗液，旋蒸濃縮得到白色固體，固體溶解于N,N-二甲基甲酰胺(12 mL)中后，加入4-甲氧基水楊醛(913 mg, 6.0 mM)和乙酸鈉(738 mg, 9.0 mM)。將得到的混合物在120 ℃下回流1 h。溶液冷卻至室溫，加水生成大量黃色固體。過(guò)濾，濾渣依次用水(30 mL)和冷乙醇(10 mL)洗滌得到7-甲氧基-3-乙酰氨基香豆素。不經(jīng)進(jìn)一步純化，化合物溶解于濃鹽酸(20 mL)、乙醇(10 mL)和水(10 mL)的混合物中。回流反應(yīng)1 h。冷卻至室溫，加入碳酸氫鈉至無(wú)氣泡產(chǎn)生。過(guò)濾，沉淀用水(100 mL)洗滌，真空干燥得黃色固體化合物3859 mg，產(chǎn)率75%， m.p.137～139 ℃;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 7.20(d,J=9.4 Hz, 1H), 6.82～6.81(m, 2H), 6.70(s, 1H), 4.05(s, 2H), 3.84(s, 3H);13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ: 159.9, 159.2, 150.5, 129.9, 126.0, 114.6, 112.7, 112.4, 100.9, 55.8; IRνν: 1705, 1646, 1622, 1591, 1506, 1440, 1304, 1272, 1253 cm-1; MSm/z: calcd for C10H10NO3{[M+H]+}192.0661, found 192.0649。

(2) 化合物4的合成

將化合物3(180 mg, 0.94 mM)和溴乙酸(130 mg, 0.94 mM)加入至水10 mL中，在95 ℃下反應(yīng)3 h。冷卻至室溫過(guò)濾，用水和二氯甲烷洗滌濾渣，干燥后得到化合物495 mg，淡棕色固體，產(chǎn)率41%， m.p.188～190 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.32(d,J=9.3 Hz, 1H), 6.83～6.86(m, 2H), 6.48(s, 1H), 3.93(s, 2H), 3.82(s, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 171.2, 158.7, 157.9, 148.6, 130.5, 126.0, 114.7, 112.4, 106.1, 100.5, 55.6, 44.6; IRν: 3285, 1703, 1633, 1513, 1421, 1274, 1248, 1196, 1159 cm-1； MSm/z: calcd for C12H10NO5{[M+H]+}248.0564, found 248.0564。

(3) 化合物5的合成

將亞硝酸叔丁酯(0.03 mL, 0.25 mM)滴加至化合物4(51 mg, 0.2 mM)的四氫呋喃(3 mL)溶液中，并在室溫下攪拌1.5 h之后，加入三氟乙酸酐(0.03 mL, 0.25 mM)繼續(xù)反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，用飽和的NaHCO3水溶液10 mL淬滅混合物。有機(jī)相用(3×15 mL)的二氯甲烷萃取，合并后用無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸濃縮。采用硅膠柱層析的方法進(jìn)行提純分離(EA∶CH2Cl2=5∶95)得到化合物535 mg，黃色固體，產(chǎn)率68%， m.p.188～190 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.45(s, 1H), 7.61(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.32(s, 1H), 7.03(dd,J=8.7 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.94(d,J=2.3 Hz, 1H), 3.96(s, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 168.8, 166.0, 156.4, 154.5, 138.2, 131.2, 116.8, 115.2, 110.4, 101.1, 97.4, 56.4; IRν: 3285, 1703, 1633, 1513, 1421, 1274, 1248, 1196, 1159 cm-1; MSm/z: calcd for C12H9N2O5{[M+H]+}261.0506, found 261.0504。

(4) 化合物6的合成

將溴丙炔(0.980 mg, 7.36 mM)緩慢滴入至溶解有N-羥基氨基甲酸叔丁酯(0.967 g, 7.72 mM)和碳酸鈉(1.560 g, 14.7 mM)的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，加熱至70 ℃攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后混合物加入適量水，用乙酸乙酯萃取三次。有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液(50 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后真空濃縮。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化 (PE∶EA=10∶1)得化合物6510 mg，無(wú)色油狀液體, 產(chǎn)率41%;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 4.34(br.s, 2H), 2.36(t, 1H), 1.34(s, 9H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 156.4, 82.1, 78.2, 75.6, 63.7, 28.2(3C); IR(KBr)ν: 3291, 2980, 1725, 1478, 1393, 1369, 1251, 1166 cm-1; MSm/z: calcd for C8H14NO3{[M+H]+}172.0968, found 172.0964。

(5) 化合物7的合成

將溴丙炔(80%甲苯溶液, 0.23 mL, 2.07 mM)滴加至N,O-二Boc-羥胺(0.435 g, 1.86 mM)和K2CO3(0.343 g, 2.48 mM)的DMF(15mL)溶液中?；旌衔锍?cái)嚢璺磻?yīng)16 h后加入水(100 mL)，乙酸乙酯(2×50 mL)萃取混合物。有機(jī)相合并后依次用水(2×100 mL)和飽和食鹽水(100mL)洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，得到化合物70.304 g為無(wú)色油狀液體，產(chǎn)率60%；1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 4.31(br.s, 2H), 2.26(t, 1H), 1.51(s, 9H), 1.48(s, 9H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 154.5, 151.9, 84.9, 83.3, 76.9, 72.6, 40.4, 28.0(3C), 27.5(3C); IR (KBr)ν: 3293, 2982, 1787, 1726, 1477, 1371, 1280, 1232 cm-1; MSm/z: calcd for C13H22NO5{[M+H]+} 272.1498, found 272.1500。

(6) 化合物10的合成

將化合物5(200 mg, 0.812 mM)與化合物6(166 mg, 0.896 mM)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(8 mL)中，再配置含有五水合硫酸銅(40.6 mg, 0.164 mM)、 BPDS(4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸二鈉鹽水合物, 87.2 mg, 0.164 mM)以及三乙醇胺(121.6 mg, 0.812 mM)的水溶液，并加入至上述的DMF溶液中，最后再加入抗壞血酸鈉(321.7 mg, 1.824 mM)，50 ℃下攪拌反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.05 M HEDTA水溶液(50 mL)，用乙酸乙酯萃取3次。有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液(50 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后真空濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(PE∶EA=3∶1)得131 mg白色粉末8。取100 mg化合物8溶解于鹽酸-乙酸乙酯混合溶液6 mL中(V∶V=1∶5)， 30 ℃下反應(yīng)，用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待原料消失后停止反應(yīng)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，得化合物1065 mg為白色粉末，產(chǎn)率78%， m.p. 186～188 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 10.99(s, 3H), 8.53(s, 1H), 8.50(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.83(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.13(s, 1H), 7.05(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 5.04(s, 2H), 3.89(s, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 163.0, 156.8, 154.0, 142.2, 132.5, 130.5, 123.0, 115.8, 113.8, 112.3, 100.9, 87.0, 56.5; IRν: 2989, 2975, 1689, 1622, 1514, 1445, 1399, 1045 cm-1; MSm/z: calcd for C14H14N3O4{[M]+}288.0984, found 288.1016。

(7) 化合物11的合成

將化合物5(200 mg, 0.812 mM)與化合物7(280 mg, 0.896 mM)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(8 mL)中，再配制含有五水合硫酸銅(40.6 mg, 0.164 mM)、 BPDS(4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸二鈉鹽水合物87.2 mg, 0.164 mM)以及三乙醇胺(121.6 mg, 0.812 mM)的水溶液，并加入至上述的DMF溶液中，最后再加入抗壞血酸鈉(321.7 mg, 1.824 mM)，50 ℃下攪拌反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.05 M HEDTA水溶液(50 mL)，用乙酸乙酯萃取三次。有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液(50 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后真空濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(PE:EA=3:1)得180 mg淡黃色液體9。取100 mg化合物9溶解于鹽酸-乙酸乙酯混合溶液6 mL中(V:V=1:5)，于30 ℃反應(yīng)至終點(diǎn)，用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。待原料消失后停止反應(yīng)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去溶劑，得化合物1152 mg為白色粉末，產(chǎn)率82%， m.p.215～216 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 11.59(br. s, 1H), 10.99(br. s, 1H), 8.57(s, 1H), 8.51(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.83(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.12(s, 1H), 7.05(dd,J=8.5 Hz, 1.5 Hz, 1H), 4.32(s, 2H), 3.89(s, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 163.0, 156.8, 154.0, 142.8, 133.0, 132.2, 130.5, 123.0, 113.8, 112.3, 111.7, 100.9, 56.5, 44.8; IRν: 2971, 2901, 1717, 1605, 1508, 1442, 1402, 1066 cm-1; MSm/z: calcd. for C14H14N3O4{[M]+}288.0984, found 288.1018。

1.3 探針的熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[46]及實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香豆素-悉尼酮的原母體結(jié)構(gòu)幾乎不產(chǎn)生熒光， 但在與炔基化合物進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)以后，其熒光性能會(huì)得到大大增強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率有明顯提高。采用1 μM硫酸奎寧(溶于0.1 M硫酸溶液)作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，將1 mM 羥胺溶液用水溶液稀釋成1 μM，然后對(duì)其進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 探針?lè)肿訉?duì)糠醛的定量衍生分析

工業(yè)上糠醛檢測(cè)所采用的國(guó)標(biāo)法即為鹽酸羥胺肟化法[55]，但是該方法誤差大，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的耗時(shí)較長(zhǎng)，因而存在很大的局限性。為此，根據(jù)合成的羥胺熒光探針的特性，以N-取代羥胺探針11為例，設(shè)計(jì)了新的驗(yàn)證探針?lè)肿优c糠醛定量衍生的方法，詳細(xì)步驟為：在1.5 mL EP管中依次加入40 μL 探針溶液(0.2 mM，去離子水溶解)、20 μL醛的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mM，純甲醇溶解)和20 μL 2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(40 mM，純甲醇溶解)，最后加入20 μL甲醇，混勻后置于20 ℃下反應(yīng)40 min。反應(yīng)后的混合物取10 μL直接注射進(jìn)色譜系統(tǒng)中，高效液相色譜采用梯度洗脫模式，洗脫程序如表1所示，其中流動(dòng)相A為乙腈-水(0.2/0.8,V/V)，流動(dòng)相B為乙腈-水(0.5/0.5,V/V)。A、B相中均加入0.02 M的乙酸和0.01 M的乙酸鈉，流速為1 mL/min。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為407 nm，柱溫箱為常溫。

表1 梯度洗脫的時(shí)間程序

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

熒光定量分析的回歸方程通過(guò)以下方法獲得：選取濃度范圍從定量限(LOQ)到4 μM的糠醛樣品用于熒光衍生，然后線性擬合熒光衍生物所對(duì)應(yīng)的色譜峰的面積和相應(yīng)的濃度得到回歸方程和對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

1.2 合成

本文合成的吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的熒光探針，與只含有香豆素結(jié)構(gòu)的熒光探針相比，不僅有更優(yōu)異的熒光性能，同時(shí)合成的香豆素-悉尼酮熒光砌塊(化合物5)可以與多種炔基化合物發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，更利于與多種不同的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行連接，合成出一系列檢測(cè)不同小分子的含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的熒光探針。

λ/nm

λ/nm圖1 化合物10和11的熒光譜圖

Figure 1FL spectra of 10 and 11

最初的實(shí)驗(yàn)方案是直接將含有兩種羥胺結(jié)構(gòu)的端炔與悉尼酮-香豆素進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)得到所需要的熒光探針，但是羥胺存在極性較大、活性較高的問(wèn)題，對(duì)點(diǎn)擊反應(yīng)產(chǎn)生了干擾。于是本實(shí)驗(yàn)采用引入保護(hù)基的方案來(lái)減少點(diǎn)擊反應(yīng)中副反應(yīng)的發(fā)生，在經(jīng)過(guò)多次嘗試后，最終選擇并合成了含有Boc基團(tuán)的炔基化合物6和7，以便于點(diǎn)擊反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，同時(shí)提高產(chǎn)率，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

N-取代羥胺合成的傳統(tǒng)方法一般通過(guò)醛類(lèi)化合物發(fā)生肟化反應(yīng)得到含有肟式結(jié)構(gòu)的中間體，然后與強(qiáng)還原劑發(fā)生還原反應(yīng)得到相應(yīng)的羥胺化合物(Scheme 3)。該類(lèi)反應(yīng)往往條件復(fù)雜，副產(chǎn)物較多，不利于較為復(fù)雜的羥胺化合物的合成。而本文采用的方案較為簡(jiǎn)便，條件溫和，有望用于其他N-取代羥胺化合物的合成之中。

2.2 10與11的熒光光譜及熒光量子產(chǎn)率

化合物10與11的熒光光譜見(jiàn)圖1。由圖1可知，兩種化合物的斯托克斯位移分別為67 nm和68 nm，相應(yīng)的物理常數(shù)見(jiàn)表2。綜合圖1和表2可知，新合成的含吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的探針具有良好的熒光量子產(chǎn)率。

Time/min

2.3 化合物11與糠醛的衍生分析結(jié)果

化合物11與糠醛的衍生結(jié)果如圖2所示。相較于空白樣，在加入混合糠醛以后，色譜圖中分別在12 min、 18 min、 22 min出現(xiàn)了3個(gè)新峰，對(duì)應(yīng)的是3種糠醛的具有硝酮結(jié)構(gòu)的衍生產(chǎn)物(N-取代羥胺基香豆素與呋喃醛的硝酮化反應(yīng))。這與其他研究報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似[38-40,56-57]。而其他常用的檢測(cè)試劑，例如2,4-二硝基苯肼(DNPH)和鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)在與糠醛類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)時(shí)，在色譜圖上會(huì)有兩個(gè)主要的衍生產(chǎn)物峰。根據(jù)肟化反應(yīng)原理，這兩種衍生試劑在與羰基類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)時(shí)會(huì)生成順-反兩種異構(gòu)體[38-40,58-59]，而本文設(shè)計(jì)的方法只生成單一的衍生產(chǎn)物峰，且具有較高的靈敏性，因此可用于準(zhǔn)確測(cè)定糠醛類(lèi)物質(zhì)。

隨后，繼續(xù)通過(guò)質(zhì)譜分析，進(jìn)一步證實(shí)了衍生產(chǎn)物的生成。質(zhì)譜圖(圖略)中的衍生物質(zhì)譜峰信號(hào)強(qiáng)烈，表明吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)氮原子的存在有助于質(zhì)譜的離子化。因此，本文合成的香豆素吡唑羥胺熒光探針也有望在單獨(dú)基于質(zhì)譜分析的醛類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。

表3 硝酮化反應(yīng)分析糠醛混合物所得線性范圍、線性方程、檢出限和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

本分析方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和檢出限如表3所示。由表3可知，以3種糠醛定量限(LOQ， S/N=10)的濃度到 4000 nM 為線性范圍，在此范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997～0.9999；檢測(cè)限(LOD， S/N=3)為0.4～0.8 nM，能夠滿(mǎn)足食品中糠醛類(lèi)化合物含量的檢測(cè)。

以香豆素-悉尼酮為熒光合成砌塊，通過(guò)它與Boc基團(tuán)保護(hù)的炔基羥胺的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)最終得到了兩種具有吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的羥胺類(lèi)熒光探針。由于吡唑香豆素結(jié)構(gòu)的存在，其熒光性能良好，N-取代和O-取代探針的熒光量子產(chǎn)率分別達(dá)到0.72和0.76。之后以N-取代羥胺為例，分別與食品中常見(jiàn)的糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛進(jìn)行了熒光衍生，并用HPLC-FLD以及HR-MS進(jìn)行了分析表征。初步的研究結(jié)果表明：三種糠醛衍生后形成的硝酮化合物在HPLC-FLD中實(shí)現(xiàn)了基線分離，具有較強(qiáng)的熒光衍生峰和色譜學(xué)行為，當(dāng)三種糠醛的濃度在0～4000 nM時(shí)，熒光強(qiáng)度與濃度有著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2良好(≥ 0.9997)，檢測(cè)限較低(≤ 0.8 nM)，重現(xiàn)性好。吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)氮原子的存在，有助于衍生產(chǎn)物在質(zhì)譜分析中的離子化，并增強(qiáng)質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度。