李鳴， 李亮， 李偉男， 巴元明

(1.湖北省中醫(yī)院 老年病科，湖北 武漢 430061； 2.湖北省中醫(yī)院 腎病科，湖北 武漢 430061)

IgA腎病(immunoglobulin A nephropathy, IgAN)是世界上最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎且是慢性腎臟疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素[1]。IgAN的發(fā)病率因地理位置的不同而存在一定的差異，東亞的發(fā)病率最高。研究表明27%的歐洲和北美的IgAN患者有終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)或10年后腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)下降50%，而來(lái)自東亞的IgAN患者發(fā)生ERSD的機(jī)率更大[2-4]。由于IgAN給社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)，因此也越來(lái)越受到國(guó)際廣泛的關(guān)注。

近年來(lái)，許多研究提出了IgAN發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)。目前主要觀點(diǎn)為呼吸道或者腸道黏膜感染，可激活初始B細(xì)胞成為分泌IgA1抗體的細(xì)胞，而在IgAN患者體內(nèi)黏膜免疫細(xì)胞分泌存在半乳糖缺陷的IgA1，引起自身免疫抗體的產(chǎn)生，然后自身抗體與存在半乳糖缺陷的IgA1結(jié)合，在體循環(huán)中形成免疫復(fù)合物并沉積于腎小球系膜中，最后沉積腎小球的免疫復(fù)合物通過(guò)釋放細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及激活補(bǔ)體等方式導(dǎo)致腎小球損傷[5-6]。

目前的研究數(shù)據(jù)表明，IgAN的發(fā)病率因種族而異，而且有家庭聚集的趨勢(shì)，IgAN的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素有關(guān)。多項(xiàng)研究表明在IgAN患者中存在異常表達(dá)或突變的基因，如黏膜感染(DEAF,ITGAM,ITGAX)[7-8]、黏膜IgA的產(chǎn)生(LIF,OSM)10、IgA1的異常糖基化(C1GALT1,C1GALT1C1)以及補(bǔ)體的活化(CFHR1,CFHR3)[9]。但是這些異常表達(dá)或突變的基因僅在部分IgAN患者身上出現(xiàn)，提示可能有大量的疾病相關(guān)基因或位點(diǎn)尚未被發(fā)現(xiàn)。因此，需要發(fā)現(xiàn)新的關(guān)鍵基因來(lái)進(jìn)一步了解IgAN的發(fā)病機(jī)制，以完善現(xiàn)有的假說(shuō)以及診斷和治療策略。

1 資料與方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源

高通量功能基因組(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 是含有多種疾病高通量基因表達(dá)的臨床數(shù)據(jù)庫(kù)[10]，本研究以“IgAN”為搜索詞，通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索和篩選，選擇出含有IgAN患者和正常腎臟捐獻(xiàn)者腎小球區(qū)活檢組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)GSE37460及GSE93798，其中GSE37460有27例IgAN患者和27例正常腎臟捐獻(xiàn)者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，GSE93798有20例IgAN患者和22例正常腎臟捐獻(xiàn)者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 基因表達(dá)數(shù)據(jù)處理和差異基因篩選流程

本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)IgAN的關(guān)鍵差異基因進(jìn)行探索，具體研究流程見(jiàn)圖1。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與IgAN相關(guān)的兩個(gè)數(shù)據(jù)集GSE37460和GSE93798。

基因表達(dá)數(shù)據(jù)通過(guò)R語(yǔ)言軟件(version 3.6.0; http://www.r-project.org/)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，隨后以|log2FC|>1和校正P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，使用R軟件的limma包[11]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選。最后通過(guò)韋恩圖獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)集的共同差異基因，該共同差異基因認(rèn)為是IgAN中表達(dá)有差異的基因。

圖1 IgA腎病關(guān)鍵基因篩選及分析流程圖

1.3 GO和KEGG的富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言軟件的clusterProfiler包[12]對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析。GO富集分析包含生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)3個(gè)方面。富集分析以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù) (STRING, https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，以蛋白間互作評(píng)分>0.4為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。采用Cytoscape軟件(version 3.7.1)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，通過(guò)其內(nèi)置的cytoHubba[13]進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選，篩選方法選擇MCC算法，其中連通度最大的前10個(gè)基因作為關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

Nephroseq數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www:nephroseq.org)是存儲(chǔ)了腎臟疾病及其對(duì)照組的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的臨床數(shù)據(jù)庫(kù)，其被廣泛用于腎臟病的研究。本研究通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證。兩組間關(guān)鍵基因表達(dá)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.6 關(guān)鍵基因與IgA腎病臨床特征的關(guān)系

通過(guò)Nephroseq數(shù)據(jù)庫(kù)探索關(guān)鍵基因?qū)gAN患者腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate, GFR)、血肌酐(serum creatine, SCr)和蛋白尿(proteinuria)的影響。關(guān)鍵基因與IgAN患者GFR、SCr的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。關(guān)鍵基因與IgAN患者蛋白尿的關(guān)系采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果

R語(yǔ)言軟件對(duì)GSE93798和GSE37460基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理的結(jié)果見(jiàn)圖2。GSE93798總共篩選出341個(gè)差異基因，其中包含102個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和239個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，GSE37460總共篩選出120個(gè)差異基因，其中包含53個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和67個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。兩組數(shù)據(jù)集差異基因的可視化結(jié)果見(jiàn)圖3。利用韋恩圖篩選出兩組數(shù)據(jù)集的共同差異基因70個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因24個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因46個(gè)(圖4)。

A：代表GSE93798的標(biāo)準(zhǔn)化處理；B：代表GSE37460的標(biāo)準(zhǔn)化處理A: Represents the standardization of GSE93798; B: Represents the standardization of GSE37460

A：GSE93798差異基因火山圖；B：GSE37460差異基因火山圖；C：GSE93798差異基因聚類分析熱圖；D：GSE37460差異基因聚類分析熱圖A: The volcano plots of GSE93798; B: The volcano plots of GSE37460; C: The heatmap of GSE93798; D: The heatmap of GSE37460

圖4 數(shù)據(jù)集共同基因的韋恩圖

2.2 GO和KEGG富集分析

R語(yǔ)言軟件中的clusterProfiler包對(duì)共同差異基因GO和KEGG富集分析結(jié)果如下。GO分析的CC的結(jié)果表明，差異基因主要富集于含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)(collagen-containing extracellular matrix)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、細(xì)胞尖部(apical part of cell)、刷狀緣膜(brush border membrane)及血液微粒(blood microparticle)等。BP的結(jié)果表明，差異基因主要涉及有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)(organic anion transport)、毒性物質(zhì)反應(yīng)(response to toxic substance)、血小板脫粒(platelet degranulation)、有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)(organic acid transport)和羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)(carboxylic acid transport)等。MF結(jié)果顯示，差異基因主要富集于抗氧化活性(antioxidant activity)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分(extracellular matrix structural constituent)、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性(anion transmembrane transporter activity)、維生素結(jié)合(vitamin binding)及有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性(organic anion transmembrane transporter activity)等(圖5，表1)。此外，本研究通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)上述差異基因涉及到的信號(hào)通路為PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)、蛋白質(zhì)消化吸收(Protein digestion and absorption)、PPAR信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)和補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)(complement and coagulation cascades)(圖6，表2)。

圖5 共同差異基因GO富集分析

表1 共同差異基因的GO富集分析結(jié)果1)Table 1 The GO enrichment analysis of overlapped differentially expressed genes

圖6 共同差異基因的KEGG富集分析

表2 共同差異基因的KEGG富集分析1)Table 2 The KEGG enrichment analysis of overlapped differentially expressed genes

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

將差異基因?qū)胫罶TRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到一個(gè)含57個(gè)節(jié)點(diǎn)和143條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖7A)，通過(guò)MCC算法選取前10個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镃SF1R、TYROBP、C1QB、C1QA、CD14、VSIG4、ALB、APOH、FN1和HRG。其中ALB、APOH和HRG表達(dá)下調(diào)，而CSF1R、TYROBP、C1QB、C1QA、CD14、VSIG4和FN1表達(dá)上調(diào)(圖7B)。

方形為表達(dá)下調(diào)基因，圓形為表達(dá)上調(diào)基因Squares represent down regulated genes and circles represent upregulated genes

2.4 關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

關(guān)鍵基因的表達(dá)和IgAN的相關(guān)性通過(guò)已有的腎病臨床數(shù)據(jù)庫(kù)(Nephroseq)進(jìn)行驗(yàn)證，Nephroseq的結(jié)果顯示，與正常腎臟捐獻(xiàn)者相比，IgAN患者ALB,APOH和HRG基因的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而CSF1R、TYROBP、C1QB、C1QA、CD14、VSIG4和FN1基因的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，該結(jié)果與本次得到的關(guān)鍵基因的表達(dá)趨勢(shì)一致(圖8)。

1)P<0.01

2.5 關(guān)鍵基因與IgA腎病臨床特征的關(guān)系

通過(guò)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，APOH、HRG的mRNA表達(dá)與IgAN患者的GFR[單位為mL/(min·1.73 m2)]呈正相關(guān)(圖9A,B)，而C1QA、C1QB、CD14、FN1、TYROBP及VSIG4的mRNA的表達(dá)與IgAN患者的GFR呈負(fù)相關(guān)(圖9C-H)。另外，APOH、HRG的mRNA表達(dá)與IgAN患者的SCr呈負(fù)相關(guān)(圖10A,B)，而C1QA、C1QB、CD14、FN1、TYROBP及VSIG4的mRNA的表達(dá)與IgAN患者的SCr呈正相關(guān)(圖10C-H)。通過(guò)非配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IgAN患者中，腎性蛋白尿組(nephrotic proteinuria)APOH的mRNA表達(dá)低于亞腎性蛋白尿(Subnephrotic Proteinuria)組(圖11A)，而腎性蛋白尿組C1QA、C1QB、FN1、TYROBP及VSIG4的mRNA表達(dá)高于亞腎性蛋白尿組(圖11B-F)。其他關(guān)鍵基因由于結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故未在圖中列出。

圖9 部分關(guān)鍵基因與IgAN患者GFR的關(guān)系

圖10 部分關(guān)鍵基因與IgAN患者SCr的關(guān)系

(續(xù)上圖)

1)P<0.05

3 討論

IgAN是腎小球腎炎最常見(jiàn)的類型，也是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要原因。眾所周知，IgAN的發(fā)生與遺傳因素和表觀遺傳因素有關(guān)[14]。雖然目前多重打擊機(jī)制是IgAN發(fā)病的主流假說(shuō)，但其潛在分子機(jī)制仍有待探索。隨著高通量測(cè)序和微陣列技術(shù)的發(fā)展，可能有機(jī)會(huì)對(duì)IgAN的潛在分子機(jī)制有更深入的了解。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)IgAN的關(guān)鍵基因進(jìn)行了篩選，并通過(guò)已有的腎病臨床數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)部分關(guān)鍵基因與IgAN患者的臨床特征有關(guān)，如與GFR、SCr及蛋白尿存在一定的相關(guān)性，為探索IgAN的潛在分子機(jī)制及治療策略提供了方向。

本研究整合了GEO的兩個(gè)數(shù)據(jù)集，篩選得到了IgAN患者和正常腎臟捐獻(xiàn)者腎小球樣本間的70個(gè)差異基因。其中KEGG富集分析結(jié)果表明，差異基因主要富集于PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM受體相互作用等信號(hào)通路。有研究通過(guò)分離IgAN患者和對(duì)照組患者的外周血單核細(xì)胞及其亞群分析發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)控因子inversin和PTEN的蛋白表達(dá)水平較低，提示IgAN患者中PI3K-Akt信號(hào)通路被過(guò)度激活[15]。當(dāng)IgAN患者腎小球出現(xiàn)損傷時(shí)，其表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分的擴(kuò)張，目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外基質(zhì)組織參與了IgAN的發(fā)展[16-18]。

此外，本研究通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出前10個(gè)關(guān)鍵基因：CSF1R、TYROBP、C1QB、C1QA、CD14、VSIG4、ALB、APOH、FN1和HRG。其中，APOH、HRG的mRNA表達(dá)與IgA腎病患者的GFR、SCr呈正相關(guān)，而C1QA、C1QB、CD14、FN1、TYROBP及VSIG4的mRNA的表達(dá)與IgA腎病患者的GFR、SCr呈負(fù)相關(guān)。并且APOH、C1QA、C1QB、FN1、TYROBP及VSIG4的mRNA表達(dá)與IgA腎病患者蛋白尿相關(guān)。FN1是一種位于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的糖蛋白，主要編碼纖維連接蛋白。Cederholm等[19]研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者血液中存在高水平的IgA-FN復(fù)合物FN1的上調(diào)可能在IgAN的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。ALB是主要的血管內(nèi)抗氧化劑，通過(guò)其抗氧化能力參與IgAN的病理生理。ALB的缺乏可能會(huì)導(dǎo)致IgAN患者更容易出現(xiàn)終末期腎病[20]。已有研究報(bào)道CD14基因表達(dá)上調(diào)可通過(guò)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致IgAN加重且是IgAN進(jìn)展的重要標(biāo)志[21]。Chalmers等[22]研究表明通過(guò)抑制CSF1R的表達(dá)改善終末期腎臟疾病的表現(xiàn)更具有針對(duì)性，且比目前的免疫抑制療法更有優(yōu)勢(shì)。C1q是由補(bǔ)體C1qA鏈(C1QA)和補(bǔ)體C1qB鏈(C1QB)編碼的18條多肽鏈，腎小球系膜C1q沉積與IgAN患者病理特征的嚴(yán)重程度及腎臟的預(yù)后密切相關(guān)[23]。目前IgAN與HRG、VSIG4、TYROBP和APOH等關(guān)鍵基因之間的關(guān)系尚未見(jiàn)有研究。其中HRG主要表達(dá)于血漿和血小板中，主要參與血液凝血和纖維蛋白溶解的過(guò)程，Merchant等[24]研究發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷患者的HRG濃度顯著升高，而本研究中發(fā)現(xiàn)HRG在IgAN患者中也是表達(dá)上調(diào)。巨噬細(xì)胞表達(dá)的VSIG4可與細(xì)胞表面受體分子結(jié)合從而抑制T細(xì)胞的活化，VSIG4還可通過(guò)與補(bǔ)體結(jié)合清除被補(bǔ)體包被的免疫原。另有研究表明VSIG4能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)減輕腎臟損傷[25]。APOH是與凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)密切相關(guān)的載脂蛋白，又稱β2GPI(Beta 2 glycoprotein I)，研究表明血液中APOH的降低可在一定程度上改善腎功能異常和腎纖維化[26]。TYROBP為T(mén)YRO蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白，主要在循環(huán)免疫細(xì)胞中表達(dá)，可通過(guò)非特異性免疫反應(yīng)間接參與腎臟損傷[27]。

近年來(lái)，一些研究通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選了與IgAN相關(guān)的關(guān)鍵基因[28-29]。Jiang等[30]通過(guò)生物信息學(xué)方法得到與IgAN相關(guān)的10個(gè)關(guān)鍵基因：IL10RA、ITGB2、HCK、C3AR1、CYBB、LAPTM5、FCER1G、CD53、C1QA和TYROBP。其中TYROBP、C1QA、VSIG4、CSF1R基因與本研究結(jié)果相同。此外，該研究通過(guò)外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證的方式對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述關(guān)鍵基因不僅與IgAN的發(fā)病有關(guān)，還參與其他原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病。而Hu等[31]通過(guò)生物信息學(xué)方法分析出IgAN相關(guān)的關(guān)鍵基因?yàn)镕OS、EGFR、SIRT1、ALB、TFRC、JUN、IGF1、HIF1A、SOCS3、CTTN、ACTR2、CREB1和CTNNB1，這與本研究的結(jié)果有所差異，由于該研究?jī)H納入GSE93798一個(gè)數(shù)據(jù)集，樣本量相對(duì)來(lái)說(shuō)較小。而本研究與之前已發(fā)表的IgAN生物信息學(xué)研究相比，采用多個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并研究，且采用R語(yǔ)言中的limma、clusterProfiler工具對(duì)納入的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。此外，本研究篩選出來(lái)的前10個(gè)基因采用Nephroseq數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中ALB、APOH和HRG基因的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而CSF1R、TYROBP、C1QB、C1QA、CD14、VSIG4和FN1基因的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，與本次研究得到的關(guān)鍵基因的表達(dá)趨勢(shì)一致。本研究也存在著一定的局限性：首先，本研究的樣本量不是很大，因此難以篩選出與IgAN關(guān)系更密切的關(guān)鍵基因。其次，本研究的結(jié)果還需要更多的分子實(shí)驗(yàn)來(lái)探索關(guān)鍵基因與IgAN之間的關(guān)系。

綜上，在本研究的基礎(chǔ)之上，后期擬通過(guò)整合國(guó)內(nèi)外更新的IgAN數(shù)據(jù)集及臨床IgAN患者基因測(cè)序結(jié)果以獲得更加充足的數(shù)據(jù)源進(jìn)行進(jìn)一步分析。另外，可通過(guò)對(duì)IgAN患者病理組織進(jìn)行免疫組化、western blot等分子實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證關(guān)鍵差異基因的表達(dá)情況。最后，將篩選出來(lái)的關(guān)鍵基因映射于藥物分子數(shù)據(jù)庫(kù)中，以期初步探索干預(yù)IgAN疾病發(fā)生發(fā)展的治療手段。

作者貢獻(xiàn)聲明

李鳴：統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并撰寫(xiě)論文；李亮：提出研究思路和框架、撰寫(xiě)并修改論文；李偉男：收集數(shù)據(jù)并修改論文；巴元明：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、指導(dǎo)數(shù)據(jù)分析并修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助不存在潛在利益沖突。