林永創(chuàng)， 李依米， 吳璐璐， 羅慧娟， 肖小敏*

(1.暨南大學 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 廣東 廣州 510632； 2.宜昌市第二人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 湖北 宜昌 443000)

胎兒期的人類腸道已開始出現(xiàn)微生物，并在出生后進一步豐富，腸道菌群在人體的消化吸收、內(nèi)分泌、免疫、甚至神經(jīng)精神等方面均發(fā)揮著重要作用[1-2]。同時，腸道菌群的紊亂失調(diào)也與多種疾病相關(guān)，如兒童哮喘、過敏性疾病、妊娠期糖尿病等[3-6]，其中，妊娠期糖尿病除了會增加產(chǎn)科風險外，還可能升高新生兒黃疸發(fā)生率、影響新生兒神經(jīng)發(fā)育等[7-8]。鑒于腸道菌群對宿主健康的重要影響，腸道菌群的相關(guān)研究逐漸成為熱點，盡管有關(guān)嬰兒腸道菌群特點的相關(guān)研究日益增多，但目前涉及胎糞的研究，尤其是國內(nèi)的研究仍然較少?；谝陨媳尘埃狙芯繉φＨ焉镯槷a(chǎn)嬰兒進行為期6個月的追蹤研究，了解健康順產(chǎn)新生兒胎糞菌群及其在出生后6個月內(nèi)的發(fā)育變化特點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究于2017年3月至2018年5月招募于暨南大學附屬第一醫(yī)院規(guī)律產(chǎn)檢、分娩的中國國籍、初次妊娠、單胎、孕前BMI正常(18.5～24 kg·m-2)，并排除高齡、流產(chǎn)史、胃腸道病史、孕期陰道炎病史、免疫性疾病、妊娠合并內(nèi)外科疾病及妊娠并發(fā)癥等病史的孕婦，獲得其書面知情同意，在其新生兒經(jīng)陰道順產(chǎn)后納入研究并追蹤至出生6月齡。嬰兒納入標準：足月順產(chǎn)新生兒，母乳喂養(yǎng)；排除標準：體質(zhì)量不足2 500 g或大于4 000 g,分娩時出現(xiàn)窒息等并發(fā)癥,患有先天性疾病、感染等。本研究方案獲得暨南大學附屬第一醫(yī)院的倫理批準(倫理號：[2019]倫審批科011號)。

1.2 樣本采集

新生兒出生后第1次胎糞、第3天糞便標本在醫(yī)院內(nèi)由經(jīng)統(tǒng)一培訓的2名工作人員收集，使用同一批次的標準無菌收集管從紙尿褲上收集糞便，取糞便的內(nèi)部實質(zhì)，避免混入尿液或其他雜物，取3～5 g放入清潔標本盒內(nèi)，30 min內(nèi)送至-80 ℃冰箱保存。出生后第14天及6個月時的糞便在嬰兒家中收集，嬰兒排便后30 min內(nèi)將帶有嬰兒糞便的紙尿褲(出生后6個月內(nèi)的嬰兒使用同一批次紙尿褲)存放家用冰箱冷凍室內(nèi)，24 h內(nèi)由工作人員上門經(jīng)上述方式收集后送至-80 ℃冰箱。收集樣品：第1次胎糞，出生后第3天、14天及6個月糞便，編號依次為F0d、F3d、F14d、F6m。

1.3 標本的處理與檢測

所有標本送諾禾致源公司檢測，從每一份標本中提取菌群基因組DNA，選擇16S V4區(qū)引物515F-806R，使用New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer對目的基因進行PCR檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣, 充分混勻后使用1×TAE和2%瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標條帶；使用Thermo Fisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Thermo Fisher的Ion S5TMXL進行上機測序。

1.4 統(tǒng)計學分析

測序所得原始數(shù)據(jù)首先基于SMRT Portal version 2.3.0 中的RS_ReadsOfinsert.1 protocol 進行相應的barcode 拆分，然后進行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。將聚類一致性參數(shù)設(shè)置為97%，利用Uparse 軟件將所得有效數(shù)據(jù)聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)；過濾后的原始數(shù)據(jù)與生成的OTUs代表序列進行比對以生成OTUs豐度表。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Simpson指數(shù)、Unifrac距離，用R語言軟件分析Alpha多樣性指數(shù)、進行主坐標分析(principle coordinate analysis，PCoA)；用LDA Effect Size(LEfSe)軟件將LDA值設(shè)置為4進行LEfSe分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒出生時一般情況

本研究共納入12例新生兒，出生時平均分娩孕周為(39.1±3.48)周，出生后1 min及5 min的Apgar評分分別為9分和10分，新生兒出生體質(zhì)量為(3.5±0.18)kg，平均身長為(49.7±0.41)cm，平均頭圍為(35.5±1.85)cm。

2.2 出生后6個月內(nèi)嬰兒腸道菌群α多樣性隨年齡的變化

Simpson指數(shù)是指從一個樣本數(shù)據(jù)中隨機取兩個OTUs，它們屬于不同物種的概率。這一概率越大表示樣本的物種多樣性越高，反之越低。該指數(shù)可以評估優(yōu)勢種在群落中的地位和作用。出生后第3天糞便菌群α多樣性(Simpson指數(shù))明顯降低，與第1次胎糞及第14天糞便樣本差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.00;P=0.01)，出生后第14天與6個月的糞便差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

1)P<0.05

2.3 出生后6個月內(nèi)嬰兒腸道菌群β多樣性隨時間的變化

以基于OTUs水平的Unweighted UniFrac主坐標分析(principle coordinate analysis，PCoA)來表示腸道菌群的β-多樣性。出生后6個月內(nèi)4個時期的嬰兒腸道菌群的β多樣性如圖2所示，主成分1 (PC1)、主成分2 (PC2)分別為21.44%、7.7%。左上象限是新生兒第3天和14天兩個時期，見明顯聚類；與出生后第1次胎糞(右上象限)和6月齡嬰兒糞便菌群(右下象限)分別構(gòu)成相距較遠的3個區(qū)域，提示腸道菌群的β多樣性在胎兒期、新生兒期及6月齡嬰兒差異明顯。

圖2 6月內(nèi)嬰兒4個時期腸道菌群主坐標分析

2.4 出生后6個月內(nèi)各時期嬰兒腸道菌群LEfSe分析

LEfSe分析方法常用于分析不同樣本之間微生物物種差異，本研究在LEfSe分析方法中，將LDA值按默認值設(shè)置為4進行微生物差異分析得到LDA值分布柱狀圖及進化分支圖。LDA值分布柱狀圖用于顯示兩樣本微生物間存在明顯差異的物種分類；進化分支圖用于表示LDA值分布柱狀圖中提示存在明顯差異的物種的系統(tǒng)發(fā)育分布。

2.4.1 出生后第1次胎糞與第3天糞便比較

圖3為經(jīng)LEfSe分析方法所得LDA值分布柱狀圖，表示當設(shè)定LDA值為4時，兩個時期腸道菌群經(jīng)LEfSe分析有統(tǒng)計學差異的物種，可見與出生時相比，出生后第3天時新生兒腸道菌群門層面上變形菌門相對豐度顯著減少，擬桿菌門(bacteroidetes)相對豐度顯著增加；屬層面上羅爾斯通菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、不動桿菌屬、乳酸菌屬(lactobacillus)和羅姆布茨菌屬(romboutsia)顯著減少，而鏈球菌屬(streptococcus)明顯增加。圖4(進化分支圖)中可見變形菌門的減少主要是由于伯克霍爾德氏菌科(burkholderiaceae)、莫拉氏菌科(moraxellaceae)、鞘氨醇單胞菌科(sphingomonadaceae)這3個菌科減少所致，結(jié)合圖3，這3個菌科中明顯減少的菌屬分別對應羅爾斯通菌屬、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬，可見變形菌門相對豐度的減少主要由上述3個菌屬減少所致。

p_bacteroidetes擬桿菌門,g_streptococcus鏈球菌屬，p_proteobacteria變形菌門，f_burkholderiaceae伯克霍爾德氏菌科, f_moraxellaceae莫拉氏菌科,f_sphingomonadaceae鞘氨醇單胞菌科，g_ralstonia羅爾斯通菌屬,g_acinetobacter不動桿菌屬,g_sphingomonas鞘氨醇單胞菌屬,g_lactobacillus乳酸菌屬

圖中從內(nèi)至外輻射的圓圈代表門至屬的分類級別，圓圈上的小點表示圓圈所在分類水平下的分類，點的大小表示其相對豐度；黃色的小點表示無統(tǒng)計學差異的物種，紅色小點表示第一次胎糞樣本較第3天糞便樣本相對豐度顯著增加的微生物系統(tǒng)發(fā)育分布，綠色小點表示第3天糞便樣本較第1次胎糞樣本相對豐度顯著增加的微生物系統(tǒng)發(fā)育分布

2.4.2 出生后第3天和第14天糞便比較

從出生后第3天到第14天的過程中，未見有相對豐度明顯變化的菌門；屬層面上見巨單胞菌屬(megamonas)減少，而雙歧桿菌屬、韋永氏菌屬(veillonella)、parabacteroides菌屬增加。結(jié)果見圖5、6。

g_bifidobacterium雙歧桿菌屬,g_veillonella韋永氏菌屬,g_megamonas巨單胞菌屬

圖中從內(nèi)至外輻射的圓圈代表門至屬的分類級別，圓圈上的小點表示圓圈所在分類水平下的分類，點的大小表示其相對豐度；黃色的小點表示無統(tǒng)計學差異的物種，紅色小點表示第14天樣本較第3天樣本相對豐度顯著增加的微生物系統(tǒng)發(fā)育分布，綠色小點表示第3天樣本較第14天樣本相對豐度顯著增加的微生物系統(tǒng)發(fā)育分布

2.4.3 出生后第14天與6個月糞便比較

出生后第14天到6個月過程中，由圖7可見在門層面上放線菌門相對豐度顯著增加；屬層面上見鏈球菌屬、parabacteroides菌屬相對豐度減少，雙歧桿菌屬、erysipelatoclostridium屬、丹毒絲菌科(erysipelotrichaceae)部分未確定的菌屬以及毛螺菌科(lachnospiraceae)部分未確定的菌屬相對豐度增加。結(jié)合圖7、8，可以推測，放線菌門相對豐度的增加主要是雙歧桿菌科(bifidobacteriaceae)、雙歧桿菌屬的增加引起的。

p_actinobacteria放線菌門，f_bifidobacteriaceae雙歧桿菌科，g_bifidobacterium雙歧桿菌屬，g_streptococcus鏈球菌屬

2.5 出生后6月內(nèi)嬰兒腸道菌群變化趨勢

在本研究中，出生后6月內(nèi)嬰兒腸道菌群門層面相對豐度顯著變化的主要是變形菌門與放線菌門，其余菌門相對豐度變化無統(tǒng)計學差異，見圖9；

圖中從內(nèi)至外輻射的圓圈代表門至屬的分類級別，圓圈上的小點表示圓圈所在分類水平下的分類，點的大小表示其相對豐度；黃色的小點表示無統(tǒng)計學差異的物種，紅色小點表示第14天糞便樣本較第6個月樣本相對豐度顯著增加的微生物系統(tǒng)發(fā)育分布，綠色小點表示第6個月樣本較第14天樣本相對豐度顯著增加的微生物系統(tǒng)發(fā)育分布

圖9 嬰兒6月內(nèi)腸道變形菌門與放線菌門相對豐度變化趨勢

新生兒出生第一次胎糞變形菌門相對豐度高達48%，出生第3天迅速下降至18.3%，結(jié)合前文的LEfSe差異物種分析可知，主要是羅爾斯通菌屬、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的迅速減少；此后變形菌門保持相對穩(wěn)定；第一次胎糞中放線菌門相對豐度僅1.9%，隨年齡增長迅速上升，6月齡時高達43.1%，結(jié)合LEfSe差異物種分析可知，主要增加的菌屬是雙歧桿菌屬。

3 討論

目前，人類腸道菌群被公認是具有重要功能的人體“器官”之一，然而該器官形成于新生兒出生后，還是在宮內(nèi)胎兒期就已經(jīng)形成？備受人們關(guān)注?！疤ゼS”顧名思義，是胎兒的糞便，在新生兒出生前已形成，且出生后第1次胎糞受外界環(huán)境因素影響相對較小，因此第1次胎糞菌群被認為可以間接反映胎兒腸道菌群[9]，本課題組在新生兒第1次胎糞中發(fā)現(xiàn)了大量的微生物，提示人類腸道菌群定植可能始于宮內(nèi)時期，與近年來的一些研究結(jié)果相似[10]。盡管近年來不少研究在新生兒胎糞中發(fā)現(xiàn)大量微生物[9-11]，但是對于新生兒腸道菌群的定植是否開始于宮內(nèi)時期仍存有爭議，例如Kennedy等[12]經(jīng)過研究認為健康足月新生兒腸道菌群的定植并非開始于宮內(nèi)時期。因此，有關(guān)人類腸道菌群在胎兒時期已開始定植的結(jié)論尚需更多后續(xù)研究，如選擇剖宮產(chǎn)新生兒胎糞或者肛門拭子，或者進行動物實驗剖宮取胎于無菌環(huán)境下收集宮內(nèi)時期腸道內(nèi)容物進行分析。

此外，與相對穩(wěn)定的成人腸道菌群不同[13],新生兒腸道菌群在分娩后進行了明顯地“重建”，在本研究中表現(xiàn)為出生后腸道菌群多樣性、部分菌群的相對豐度隨時間動態(tài)變化，與既往研究結(jié)果類似[14-15]。

腸道菌群α-多樣性是顯示個體內(nèi)腸道菌群物種多樣性的重要指標，較低的腸道菌群α多樣性常被認為與多種疾病狀態(tài)相關(guān)，已有的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)腸道菌群多樣性的降低與高血壓、濕疹、兒童I型糖尿病的發(fā)病以及嬰兒的膿毒血癥的發(fā)生相關(guān)[16-18],本研究結(jié)果顯示，胎糞菌群的α多樣性與出生后第14天以及6月齡糞便樣本菌群的α多樣性相似，但出生后第3天時，腸道菌群α-多樣性明顯下降，這可能與新生兒從宮內(nèi)環(huán)境到外界環(huán)境的突然改變及新生兒腸道環(huán)境劇烈變化有關(guān)，已經(jīng)有研究表明，出生后短短幾天內(nèi)，新生兒腸道內(nèi)氧氣被需氧菌迅速消耗，快速轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧環(huán)境[19-20]，可能是造成新生兒腸道菌群α-多樣性下降的重要原因；另外，出生后第3天時，胎兒腸道中宮內(nèi)時期形成的胎糞基本排空，此時的腸道菌群可代表新生兒出生后在適應外界環(huán)境及腸道環(huán)境的劇烈變化后最初建立的菌群狀態(tài)，這也提示出生后第3天新生兒的腸道菌群可能處于比較脆弱的時期。研究表明健康新生兒出生后補充益生菌以預防相關(guān)疾病[11]，也有文獻報道新生兒期補充益生菌可以改善腸道菌群而獲益[21]；結(jié)合本研究的結(jié)果，認為健康新生兒出生后補充益生菌，有可能改善出生早期腸道菌群多樣性的降低。但是，臨床上對于正常的生理變化的干預仍需慎重，有待進一步探究。

腸道菌群β多樣性代表不同時期間腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，本研究的主坐標分析圖中可以看出，4個時期的腸道菌群在主坐標分析圖中構(gòu)成明顯分離的三個區(qū)域(其中出生后第3天與第14天明顯聚類于一個區(qū)域)。提示腸道菌群結(jié)構(gòu)在胎兒期、新生兒期及6月齡嬰兒中差異明顯，再一次表明了腸道菌群在生命的早期進行重建。

上述結(jié)果顯示，新生兒出生后腸道菌群結(jié)構(gòu)隨年齡增長發(fā)生明顯變化，那么是哪些菌門以及菌屬的變化引起腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的改變呢？

在菌門層面上胎糞菌群中變形菌門占比高達48.0%，遠高于成人腸道中變形菌門的相對豐度5.6%[22]，相比較于胎糞，出生后第3天腸道變形菌門相對豐度顯著降低，查閱文獻發(fā)現(xiàn)，母乳相關(guān)成分如人乳鐵蛋白、HMOs等對變形菌門有抑制作用[23-24]，這可能是腸道變形菌門相對豐度降低的原因之一；相比較于菌門層面的變化，菌屬層面的變化則要相對復雜，出生后3天內(nèi)新生兒腸道中減少的菌屬主要為不動桿菌、鞘氨醇單胞菌、羅爾斯通菌等，這些菌屬均歸類于變形菌門，關(guān)于這3個菌屬在新生兒腸道中作用的研究較少，其對新生兒的影響尚不明確；這一時期增加的菌屬主要是鏈球菌屬，關(guān)于鏈球菌屬的研究較多集中在其與肺炎的關(guān)系及其耐藥性等方面，但近年也有不少研究者認識到人體生命早期腸道鏈球菌的定植在機體發(fā)育過程中具有重要意義。比如有研究者發(fā)現(xiàn)部分鏈球菌(如嗜熱鏈球菌)有合成脲酶的能力，這使其能夠利用母乳中的尿素產(chǎn)生氨基酸，這被認為對鏈球菌及宿主均有益處[25]；鏈球菌還能合成多種維生素以及乳酸和乙酸[26]，這些物質(zhì)也都能夠被宿主所攝取利用。腸道鏈球菌屬不僅與上述各種物質(zhì)代謝相關(guān)，還可能與糖代謝密切相關(guān)，因為研究發(fā)現(xiàn)了鏈球菌表達大量與糖代謝相關(guān)的酶[27]，國內(nèi)的一項關(guān)于兒童腸道菌群與糖尿病的研究進一步證實了這一觀點，在這一項研究中，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)鏈球菌的持續(xù)減少可能與糖尿病的發(fā)病有關(guān)[28]。但嬰兒出生后6個月腸道中鏈球菌屬的相對豐度較前降低，與Dogra等[29]的研究相類似，他們發(fā)現(xiàn)嬰兒腸道中鏈球菌屬在出生后3周豐度最高，在出生后6個月時相對豐度降低，并且認為6月齡嬰兒腸道鏈球菌屬豐度過高可能與肥胖的發(fā)生相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，出生后第3天(新生兒早期)的腸道菌群β多樣性與第14天(新生兒晚期)的非常相似，說明新生兒早期和新生兒晚期的腸道菌群總體結(jié)構(gòu)相似，利用LEfSe差異菌屬分析法，發(fā)現(xiàn)出生后第14天時，韋永氏菌屬、雙歧桿菌屬、parabacteroides菌屬較出生后第3天時明顯增加。在腸道內(nèi)，雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌將母乳低聚糖降解成小分子的糖，這些小分子糖一部分被宿主腸道攝取，一部分被葡萄球菌、鏈球菌等進一步處理成為乳酸等，鏈球菌產(chǎn)生的乳酸可被韋永氏菌加以利用產(chǎn)生丙酸，這或許解釋了為何鏈球菌增多后韋永氏菌也隨之增多。丙酸可能有促進胸腺外Treg cell產(chǎn)生的作用，盡管嬰兒腸道內(nèi)丙酸實際上比成人少得多，仍提示韋永氏菌屬可能對新生兒免疫成熟有促進作用[30-33]。相比較上述菌屬的研究，腸道parabacteroides菌屬獲得較少的關(guān)注，但目前仍有相關(guān)研究認為該菌屬可以通過調(diào)節(jié)IL-10及Treg細胞來抑制炎癥反應[34]。

本研究結(jié)果顯示，新生兒出生后腸道菌群在門層面上主要表現(xiàn)為變形菌門相對豐度迅速降低以及放線菌門相對豐度迅速升高的趨勢；在屬層面上，出生后6月內(nèi)雙歧桿菌的屬相對豐度幾乎每一時期都較上一時期升高，至出生后6個月時，嬰兒腸道雙歧桿菌屬的相對豐度已高達41.6%，遠高于成人腸道中雙歧桿菌的相對豐度[35]。雙歧桿菌是一種被廣泛認可的益生菌，對機體的發(fā)育有著重要作用，雙歧桿菌可以將母乳低聚糖降解成小分子的糖；此外它能夠有效地競爭利用母乳HMOs[30,36-37]，并產(chǎn)生有機酸抑制致病菌的生長[23,26]；部分雙歧桿菌還有促進嬰兒免疫成熟的作用[38-39]，此外，還能夠通過分泌醋酸鹽來改善上皮細胞介導的腸道防御，從而保護宿主免受致命感染[40-41]，上述雙歧桿菌的這些作用對于機體生命早期的健康有著重要意義。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)6月齡嬰兒腸道中erysipelatoclostridium的相對豐度較新生兒期升高，目前對腸道erysipelatoclostridium的研究較少，一項關(guān)于腸道菌群與過敏性疾病關(guān)系的研究[26]發(fā)現(xiàn)，在1歲齡的兒童中，過敏性疾病組腸道內(nèi)erysipelatoclostridium較健康組減少，因此，該研究認為該菌屬可能與過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)或者可能作為過敏性疾病發(fā)病的預測因子；但是，在出生后的1年內(nèi)，健康組與疾病組中erysipelatoclostridium的相對豐度在不同時期高低互易，比如在出生后6個月的樣本中該菌屬的相對豐度在疾病組更高，而1歲時完全相反。這提示嬰兒腸道菌群對嬰兒的影響是隨時間而變化的，在出生后的不同時期，腸道菌群對機體的影響不同。此外也有人認為腸道Erysipelatoclostridium是一種機會致病菌[42]。故該菌屬在生命早期的意義尚不明確，有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，人類腸道菌群定植可能始于宮內(nèi)時期，出生后3天內(nèi)新生兒腸道菌群α多樣性顯著下降，可能意味著這一時期腸道菌群處于比較脆弱的狀態(tài)。新生兒出生后第1次胎糞變形菌門相對豐度高達48%，出生后第3天迅速下降至18.3%，主要是羅爾斯通菌屬、不動桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的迅速減少所致；此后變形菌門相對豐度保持相對穩(wěn)定；胎糞放線菌門相對豐度僅1.9%，隨年齡增長迅速上升，6月齡時高達43.1%，主要增加的菌屬是雙歧桿菌屬。

本研究不足之處在于未涉及腸道菌群功能方面的測定，原因之一是目前對腸道菌群功能的研究主要集中在某些菌屬的功能測定，但在腸道內(nèi)菌群大量豐富的背景下，研究腸道內(nèi)少數(shù)菌屬的功能可能并不足以理解腸道菌群整體的功能變化；另外，本研究僅選擇出生后6個月內(nèi)的取樣時間點，有待增加取樣的時間點以更好地反映生命早期腸道菌群發(fā)育特點及變化趨勢。

作者貢獻聲明

林永創(chuàng)：設(shè)計實驗，采集、分析、解釋數(shù)據(jù)，撰寫論文；李依米：實施研究、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；吳璐璐：采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)；羅惠娟：對文章的知識性內(nèi)容做批評性審閱，獲取研究經(jīng)費；肖小敏：提出研究思路和框架，對文章的知識性內(nèi)容做批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，指導。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。