李娜， 苗聰秀， 李莉娜， 馬甜思， 苗卉

(1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 附屬和平醫(yī)院 生殖遺傳科∥長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 生殖遺傳研究所∥山西省衛(wèi)健委生殖工程委級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 長(zhǎng)治 046000； 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院 病理科， 山西 長(zhǎng)治 046000)

胚胎著床是決定人類及哺乳動(dòng)物是否妊娠成功的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，但目前對(duì)胚胎著床的機(jī)制尚未清楚明確。胚胎著床主要受滋養(yǎng)層細(xì)胞的介導(dǎo)，其中在“著床窗”開放期，具有侵入性胚泡和處于容受狀態(tài)的子宮內(nèi)膜同步發(fā)育是決定胚泡是否成功植入的關(guān)鍵，而此過程則受極其復(fù)雜、精細(xì)的多因素調(diào)節(jié)，因此也是研究的關(guān)鍵所在[1]。部分學(xué)者將胚胎視為“良性瘤”，這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移與胚胎著床時(shí)胚胎滋養(yǎng)層侵入子宮內(nèi)膜的過程等生物學(xué)行為極為相似，并且胚胎著床的過程中也有不少在腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮作用的原癌基因和抑癌基因參與其中[2]。P53凋亡刺激蛋白抑制因子(inhibitory member of the ASPP family，IASPP)作為腫瘤基因家族的其中一員，它與目前臨床公認(rèn)較為重要的腫瘤抑制基因p53相互作用后有遏制P53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力[3]。鑒于目前有關(guān)子宮內(nèi)膜組織中IASPP的表達(dá)對(duì)胚胎著床作用的研究較少，因此本研究小組建立小鼠模型來展開其相關(guān)性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級(jí)NIH小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證編號(hào)：SCXK(京)2019-0011]。本實(shí)驗(yàn)選取6～8周齡清潔級(jí)NIH小鼠105只，體質(zhì)量分布在20～25 g，其中雌性小鼠70只，雄性小鼠35只，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置流程嚴(yán)格遵循我國(guó)科技部于2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》(國(guó)科發(fā)財(cái)字[2006]398號(hào))。

1.2 儀器和試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的儀器和試劑如下：Santa Cruz Biotechnology公司生產(chǎn)的兔抗人IASPP單克隆抗體及鼠抗人β-Actin單克隆抗體、Thermo Scientific的PierceTMBCA 蛋白定量試劑盒、北京中山生物公司生產(chǎn)的三步法免疫組織化學(xué)試劑盒、全式金公司的Top Green qPCR SuperMix試劑盒、日本OLYMPUS生產(chǎn)的HAIPS-1000高清晰彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)及原平皓生物公司的化學(xué)發(fā)光儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 子宮組織的收集

小鼠飼養(yǎng)于室溫37 ℃的環(huán)境中，設(shè)置14 h光照，10 h黑暗的條件。將雌性小鼠和雄性小鼠按2∶1合籠交配(其中雌性小鼠70只，雄性小鼠35只)，次日早上7點(diǎn)檢查雌性小鼠的陰道來判斷發(fā)情周期，未受孕的雌性小鼠記為Day 0(共8只未受孕)，其余62只雌性小鼠陰栓均呈陽(yáng)性，即診斷為妊娠，記為受孕第1天(Day 1)。

分別于妊娠Day0(未孕鼠)、2、3、4、5、6、7取出實(shí)驗(yàn)鼠，其中Day0 6只，Day2、3、5、6、7孕鼠各6只，Day4孕鼠取26只，對(duì)孕鼠進(jìn)行脫頸脫臼方法處死，解剖孕鼠取子宮組織，去除子宮周圍的結(jié)締組織，生理鹽水沖干凈并用濾紙擦干臟器表面的血污，分裝凍存于液氮備用，其余放入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中固定和保存，脫水后石蠟包埋并切片備用。

1.3.2 熒光定量PCR

將預(yù)提取RNA的子宮組織在液氮中快速冷凍2 h以上，后于-80 ℃中放置24 h，提取前在冰上解凍，取合適大小的組織塊于2 mL離心管中，加入800 μL配制好的1×RIPA蛋白裂解液，放入1顆磁珠，于高通量組織破碎儀上將組織研磨成勻漿，50 Hz，10 s/次，7～8次，注意配平。隨后通過Trizol法提取雌鼠子宮組織的總RNA，加入體積分?jǐn)?shù)為0.01%的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)溶液達(dá)到RNA溶解的目的，通過BioTek多孔酶標(biāo)儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)cDNA進(jìn)行半定量分析。引物序列：IASPP引物，上游5’-GACGTTAAACGCACTAAGCAT-3’，下游5’-GG-CTACGACCCCGTATAG-3’；β-actin引物，上游5’-TCTAATGACGTCTCGCTGCT-3’，下游5’-GTAGA-CGACGTACGTCGTCT-3’。PCR程序設(shè)置：預(yù)變性階段，95 ℃ 5 min；變性階段，94 ℃ 30 s；退火階段，60 ℃ 30 s；延伸階段，72 ℃ 45 s，循環(huán)29次；再次延伸，72 ℃ 10 min。

1.3.3 IASPP蛋白水平檢測(cè)

分別選取小鼠子宮內(nèi)膜組織約100 mg，與提取組織RNA方法類似，將子宮組織勻漿化，隨后加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)和RIPA裂解液對(duì)內(nèi)膜組織進(jìn)行蛋白裂解并均質(zhì)化處理，置于冰塊30 min，然后高速離心并取上清液，使用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白水平，于超低溫冰箱保存蛋白以備用。按說明書提前制備SDS聚丙烯酰胺，取50 μg蛋白與適量緩沖液均勻混合，于95 ℃使蛋白變性，然后進(jìn)行上樣處理。跑濃縮膠的電壓為60 V，進(jìn)入分離膠電壓為120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)染料到達(dá)分離膠底端時(shí)可以結(jié)束凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。把分離膠放置于轉(zhuǎn)移緩沖液中緩沖15 min，將大小合適的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜提前放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。用轉(zhuǎn)移緩沖液小心浸透6塊大小合適的Whatman 3 mm濾紙。將濾紙、凝膠、PVDF膜從上到下放置，然后表面再放置3張濾紙，電流設(shè)置為270 mA，轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2 h。轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% PBST溶液清洗PVDF膜，然后加入體積分?jǐn)?shù)為5%的封閉溶液，在室溫條件下緩慢震蕩1 h。往含PVDF膜的盒中放入比例均為1∶1 000的單克隆鼠抗IASPP和β-actin封閉液，放置4℃冰箱中緩慢震蕩過夜。通過PBS緩沖液洗滌清洗PVDF膜5 min，重復(fù)2次。把PVDF膜放入干凈的盒中，加入被HRP標(biāo)記且比例為1∶3 000的羊抗小鼠IgG抗體，在室溫條件下緩慢震蕩1 h，通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% PBST緩沖液洗滌清洗PVDF膜20 min，重復(fù)2次。通過ECL法觀察目的蛋白的條帶，利用Quantity One軟件定量測(cè)量。

1.3.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

選取合適的石蠟切片，脫蠟后置于體積分?jǐn)?shù)為3%的雙氧水中15 min，清除子宮組織內(nèi)的內(nèi)源性過氧化物酶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的 PBST緩沖液修復(fù)子宮組織的抗原，加入封閉液(體積分?jǐn)?shù)10%的山羊血清)對(duì)切片于37 ℃封閉處理15 min，棄去封閉液，緩慢加入兔抗人IASPP單克隆抗體(稀釋比例為1∶80)，于4 ℃孵育過夜。后加入生物標(biāo)記的羊抗兔IgG標(biāo)準(zhǔn)液，室溫孵育30 min，清洗后用辣根過氧化物酶對(duì)鏈霉卵白素工作液標(biāo)記處理，室溫孵育1 h后DAB顯色。以上各操作步驟之間均需要使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% PBST清洗，并重復(fù)2次，使用蘇木精染料對(duì)子宮組織進(jìn)行染色處理，對(duì)切片進(jìn)行徹底脫水和透明處理并封片和固定。本研究中將PBS緩沖液替代一抗試劑，并設(shè)為本研究的陰性對(duì)照組。通過HAIPS-1000高清彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)對(duì)子宮組織進(jìn)行觀察，被納入的陽(yáng)性平均值(A值)作為本研究的半定量參數(shù)，從而對(duì)IASPP蛋白分泌水平進(jìn)行定量分析。分別隨機(jī)選取未孕組小鼠和處于不同妊娠階段的孕鼠的子宮組織切片，每張子宮組織切片隨機(jī)選取著色典型的視野進(jìn)行對(duì)比。

1.3.5 小鼠子宮角注射法

選取妊娠周期為4 d的雌性小鼠共20只，然后隨機(jī)劃分成2組，用5 μL兔血清IgG分別注射對(duì)照組小鼠的左側(cè)和右側(cè)子宮角，實(shí)驗(yàn)組則對(duì)小鼠的左側(cè)子宮角注射1∶80的p53凋亡刺激蛋白抑制因子單克隆抗體5 μL，注入5 μL兔血清IgG至右側(cè)子宮角。然后在小鼠孕期的第8天后進(jìn)行剖腹快速將子宮從小鼠體內(nèi)剝離，詳細(xì)記錄子宮胚胎著床數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算IASPP在妊娠0、2、3、4、5、6、7天各組小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)；計(jì)算胚胎著床數(shù)。獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被EPidata3.1軟件進(jìn)行雙錄入處理，通過SPSS 25.0軟件(IBM, 紐約)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料通過均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，通過卡方檢驗(yàn)以及兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)的組間進(jìn)行比較，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 IASPP mRNA水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，IASPP的轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間推移而緩慢升高，mRNA的表達(dá)水平Day0為(1.12±0.04)，Day2為(0.85±0.28),Day3為(0.94±0.47)，并且于雌鼠動(dòng)情周期的第4天到達(dá)峰值(1.97±1.06)(P<0.05)，然后該水平緩慢降低，Day5為(1.30±0.38)， Day6降為(1.28±0.17)，Day7進(jìn)一步降為(0.72±0.18)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，與其他組別相比，D4存在明顯差異(P<0.05)，見圖1。

1)P<0.05

2.2 IASPP的Western blot分析

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IASPP的蛋白水平隨時(shí)間推移而緩慢增加，在雌鼠動(dòng)情周期的第5天到達(dá)峰值(P<0.05)，然后緩慢降低。以上均重復(fù)3次，與其他組別相比，D5存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖2及圖3。

圖2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雌鼠子宮內(nèi)膜中IASPP蛋白水平

1)P<0.05

2.3 IASPP蛋白的組織學(xué)定位及表達(dá)

早孕小鼠子宮腔上皮、腺上皮的胞膜和胞漿、血管內(nèi)皮以及基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中分泌IASPP蛋白，經(jīng)染色呈棕黃色顆粒狀，同時(shí)各個(gè)妊娠階段的陽(yáng)性反應(yīng)存在差異，未孕組也顯示弱陽(yáng)性(圖4中：紅色箭頭指示上皮細(xì)胞，綠色箭頭指示間質(zhì)細(xì)胞)。

如表2，除了血管上皮細(xì)胞第0天，管腔上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及腺體上皮細(xì)胞在孕期均有IASPP陽(yáng)性表達(dá)，且呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，但均在第7天出現(xiàn)下降，表現(xiàn)為第0天和第7天陽(yáng)性反應(yīng)最弱。

A:動(dòng)情間期，B:動(dòng)情后期，C、D、E、F、G、H:分別為孕2～7 d的表達(dá)A: The period of estrus, B: The later period of estrus, C, D, E, F, G, H: The expression of 2～7 days of pregnancy

表2 IASPP在妊娠期間表達(dá)強(qiáng)度的分布

2.4 IASPP對(duì)小鼠胚胎著床的影響

對(duì)孕第8天小鼠子宮的胚胎著床數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組小鼠的左側(cè)子宮的胚胎著床數(shù)是(1.402±0.517)，右側(cè)為(6.420±1.075)，對(duì)照組子宮胚胎著床數(shù)左側(cè)為(6.500±1.090)，對(duì)照組右側(cè)為(6.200±0.919)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的左側(cè)胚胎著床數(shù)與右側(cè)胚胎著床數(shù)相比，呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)(P<0.05)，對(duì)照組小鼠的左側(cè)和右側(cè)的子宮胚胎著床數(shù)目的差異不明顯(P>0.05)。

3 討論

胚胎著床作為哺乳動(dòng)物關(guān)鍵的生殖環(huán)節(jié)，其基礎(chǔ)是子宮內(nèi)膜的接受性[4]，小鼠受精后4～5 d子宮內(nèi)膜狀態(tài)和包容性達(dá)到最佳[5]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜時(shí)，蛻膜細(xì)胞經(jīng)歷的增殖和凋亡的生理活動(dòng)均是在不依賴胚胎的形式下進(jìn)行，但對(duì)其分子調(diào)控機(jī)制仍未明確[6]。IASPP與ASPP1/ASPP2同屬于P53結(jié)合蛋白家族的成員。當(dāng)人體基因組發(fā)生損壞時(shí)，p53基因能阻滯細(xì)胞周期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制細(xì)胞產(chǎn)生癌變[7]，IASPP與p53基因結(jié)合后有遏制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用[8]，目前相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)在前列腺癌、肝細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌和急性白血病等惡性腫瘤中均具有較高的IASPP表達(dá)[9]，但關(guān)于IASPP的表達(dá)對(duì)胚胎著床的作用研究相對(duì)較少。因此，基于IASPP參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的特性，子宮內(nèi)蛻膜細(xì)胞的增殖與凋亡會(huì)進(jìn)一步影響胚胎著床而展開此項(xiàng)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，早孕小鼠子宮腔上皮、腺上皮的胞膜和胞漿、血管內(nèi)皮以及基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中分泌IASPP蛋白，經(jīng)染色呈棕黃色顆粒狀，同時(shí)各個(gè)妊娠階段的陽(yáng)性反應(yīng)存在差異，雖然未孕組也顯示弱陽(yáng)性，但表達(dá)較低。以上結(jié)果說明IASPP蛋白的分泌，能明顯抑制子宮內(nèi)蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡程序，有利于蛻膜細(xì)胞的生成，至小鼠孕期第7天時(shí)IASPP的表達(dá)水平開始降低，啟動(dòng)蛻膜細(xì)胞的凋亡，形成一個(gè)完整的周期，與許萍等[10]研究結(jié)果一致，提示IASPP在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，參與蛻膜細(xì)胞的形成。本研究還發(fā)現(xiàn)，除了血管上皮細(xì)胞在未孕期(第0天)外，管腔上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腺體上皮細(xì)胞在孕期內(nèi)均有IASPP陽(yáng)性表達(dá)，且呈隨時(shí)間推進(jìn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，并在第7天開始下降，表現(xiàn)為第0天和第7天表達(dá)最弱。文獻(xiàn)研究表明這是由于機(jī)體內(nèi)的滋養(yǎng)細(xì)胞不停地生長(zhǎng)、發(fā)育、轉(zhuǎn)移，并逐漸定植于小鼠的子宮內(nèi)膜，以達(dá)到營(yíng)養(yǎng)胚胎的目的[11]。子宮角注射實(shí)驗(yàn)的小鼠胚胎著床率的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠位于左側(cè)的胚胎著床數(shù)明顯低于右側(cè)子宮的胚胎著床數(shù)，而對(duì)照組小鼠左右兩側(cè)子宮的胚胎著床數(shù)未出現(xiàn)明顯差別，說明IASPP單克隆抗體對(duì)小鼠胚胎著床具有明顯的抑制作用，但不能達(dá)到完全抑制作用。這與孟君等[12]的報(bào)道類似：增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)作為與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，其單克隆抗體具有顯著減少胚泡著床數(shù)的功能，據(jù)此推測(cè)IASPP可能是通過IASPP對(duì)DNA聚合酶的作用，致使DNA復(fù)制減少并阻礙子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與分化，影響子宮內(nèi)膜蛻膜化后削減子宮內(nèi)膜對(duì)胚泡的黏附，使蛻膜細(xì)胞的增殖與凋亡間動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，影響胚胎順利著床，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，早孕小鼠子宮內(nèi)膜組織中p53凋亡刺激蛋白抑制因子IASPP持續(xù)表達(dá)，并參與小鼠胚胎的著床調(diào)控過程。

作者貢獻(xiàn)聲明

李娜：提出研究思路和框架，實(shí)驗(yàn)操作，撰寫并修改論文；苗聰秀：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，修改論文；李莉娜：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施操作，數(shù)據(jù)分析；馬甜思：統(tǒng)計(jì)分析；苗卉：數(shù)據(jù)收集及分析。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。