馬莉， 楊文娟， 馬青梅， 馬夢(mèng)婷， 張嬌弟， 張倩， 劉欣躍，2*

(1.蘭州大學(xué) 第二醫(yī)院 藥物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730030; 2.蘭州大學(xué) 第二醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心, 甘肅 蘭州 730030)

肝癌是最常見的致死性消化道惡性腫瘤之一，在全球癌癥數(shù)據(jù)中，原發(fā)性肝癌發(fā)病率排第7、致死率排第2[1]。肝癌的分型中，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最主要的類型，約占75%[2]。雖然手術(shù)切除、介入、消融、靶向治療等方法已取得一定進(jìn)展，但由于肝癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)放化療不敏感，多數(shù)肝癌患者的預(yù)后仍較差。近年來，通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、改變腫瘤微環(huán)境來干預(yù)腫瘤進(jìn)展的免疫療法已成為一種極具潛力的臨床治療方案[3]，但仍缺乏針對(duì)肝癌有效的治療與預(yù)后標(biāo)志物。

趨化因子由具有趨化功能的細(xì)胞因子家族構(gòu)成，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。CXCL[chemokine (C-X-C motif) ligand]家族是趨化因子的重要組成部分，主要引起細(xì)胞的定向遷移，在炎癥中可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等[4]，而長期炎癥刺激是導(dǎo)致促腫瘤發(fā)生發(fā)展微環(huán)境形成的因素之一。研究表明，CXCL家族可通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)腫瘤逃避免疫監(jiān)視，影響腫瘤進(jìn)展[5]。HCC細(xì)胞通過提高CXCL1的分泌，減少腫瘤細(xì)胞凋亡來促進(jìn)肝癌進(jìn)程，而靶向沉默CXCL1可抑制腫瘤生長[6]。CXCL4具有抗炎作用，促進(jìn)其表達(dá)可緩解肝臟損傷[7]。CXCL9通過破壞細(xì)胞屏障及骨架，減少細(xì)胞黏附，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[8-9]。CXCL2、CXCL6、CXCL11、CXCL13在HCC組織中高表達(dá)，與肝癌患者的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[10]。 CXCL14是常見的腫瘤抑制因子，在肝癌組織中表達(dá)常常受到抑制[11]。CXCL3、CXCL5、CXCL8高表達(dá)與肝癌臨床分期和腫瘤浸潤密切相關(guān)[12-15]。CXCL17通過LKB1-AMPK途徑促進(jìn)HCC中的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移并抑制自噬[16]。CXCL7、CXCL12、CXCL13、CXCL16則與惡性腫瘤的肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[17]。干預(yù)CXCL9、CXCL10，可刺激T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的免疫治療[15-18]。此外，研究表明CXCL家族中的成員可能參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[19]。因此，探討CXCL家族在作為肝癌的治療與預(yù)后標(biāo)志物方面的作用，具有重要意義。

現(xiàn)有的研究僅證實(shí)了部分CXCL趨化因子的生物學(xué)功能，本研究擬通過生物信息學(xué)分析，全面預(yù)測(cè)肝癌中具有差異表達(dá)的CXCL趨化因子，并評(píng)估CXCL趨化因子與肝癌患者EMT、免疫浸潤的相關(guān)性，以探討其作為肝癌臨床治療與預(yù)后標(biāo)志物的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫選擇

1.1.1 UNIPROT

UNIPROT(https://www.uniprot.org/)是一種包含大量蛋白質(zhì)信息，包括結(jié)構(gòu)、序列和分類等的數(shù)據(jù)庫[20]。使用UNIPROT數(shù)據(jù)庫檢索CXCL家族的全部組成成員。

1.1.2 ONCOMINE

ONCOMINE(https://www.oncomine.org/)是由多種癌基因芯片組成的、能夠進(jìn)行全基因組表達(dá)分析的數(shù)據(jù)庫[21]。使用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫評(píng)估不同CXCL趨化因子在肝癌患者中的表達(dá)量。在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中依次檢索、對(duì)比HCC患者肝癌和正常肝臟組織中CXCL趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異，數(shù)據(jù)類型選擇為mRNA，以P<0.01且 Fold Change為2，篩選出排名前10%的基因數(shù)據(jù)集依次提取篩選的數(shù)據(jù)并繪制成圖。

1.1.3 TCGA

TCGA(the cancer genome atlas homepage)是一項(xiàng)包含多種人類腫瘤致癌基因組改變的公共數(shù)據(jù)庫(http://cancergenome.nih.gov/abouttcga)[22]。為確定CXCL趨化因子在肝癌中的表達(dá)量，使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CXCL家族在肝癌與正常肝臟組織中的表達(dá)量。

1.1.4 STRING

STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫[23]是一種通過計(jì)算蛋白潛在功能來預(yù)測(cè)蛋白間相互作用的在線分析網(wǎng)站。使用STRING數(shù)據(jù)庫分析CXCL家族與EMT標(biāo)志蛋白的相互作用，從而預(yù)測(cè)其在肝癌EMT中的作用。

1.1.5 TIMER

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫[24]是一種評(píng)判免疫細(xì)胞浸潤及其對(duì)疾病影響的分析網(wǎng)站。使用TIMER數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)并評(píng)估差異表達(dá)的CXCL趨化因子與肝癌患者免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。

1.2 數(shù)據(jù)分析

在數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析，或?qū)С鰯?shù)據(jù)后再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析。癌組織中目的基因表達(dá)量高于正常肝臟組織計(jì)為高表達(dá)組，反之為低表達(dá)組。在Kaplan-Meier Plotter(KMPLOT)網(wǎng)站 (http://kmplot.com/)[25]分析差異表達(dá)的CXCL趨化因子與HCC患者不良預(yù)后的相關(guān)性，并繪制生存曲線。使用R語言繪制CXCL家族的表達(dá)熱圖，并使用ESIMATE算法計(jì)算CXCL家族在肝癌腫瘤基質(zhì)微環(huán)境中immune score與 estimate score，得出其與腫瘤純度的相關(guān)性。使用R語言中的Xcell算法計(jì)算CXCL家族與免疫抑制因子及免疫抑制招募因子等的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析CXCL因子在肝癌與正常組織中的表達(dá)差異；使用Kaplan-Meier分析不同CXCL因子與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系[26]；其余統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均在相關(guān)數(shù)據(jù)庫在線完成。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者CXCL趨化因子的表達(dá)情況

UNIPROT數(shù)據(jù)庫中共檢索出16種CXCL趨化因子，分別為CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16和CXCL17?；贠NCOMINE數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示，與正常肝臟組織相比，肝癌組織中CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10和CXCL11高表達(dá)(P<0.05)，CXCL2、CXCL7、CXCL12和CXCL14低表達(dá)(P<0.05)(圖1)。基于TCGA數(shù)據(jù)庫繪制的熱圖結(jié)果顯示，所有CXCL趨化因子中，CXCL6、CXCL8、CXCL9和CXCL10在肝癌組織中相對(duì)高表達(dá)(P<0.05)，而CXCL2、CXCL12和CXCL14在肝癌中的表達(dá)量則相對(duì)低于正常肝臟組織(P<0.05)(圖2)。

2.2 CXCL趨化因子在HCC患者中的預(yù)后價(jià)值

將腫瘤組織與正常組織中表達(dá)量相近的CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL13排除，選擇CXCL2、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CXCL16、CXCL17繼續(xù)進(jìn)行下一步研究。KMPLOT數(shù)據(jù)庫的生存曲線顯示高轉(zhuǎn)錄水平的CXCL2、CXCL4、CXCL7、CXCL9、CXCL10、CXCL12，以及低轉(zhuǎn)錄水平CXCL6與肝癌患者更長的生存期顯著相關(guān)(P<0.05)(圖3)。

2.3 CXCL趨化因子與HCC細(xì)胞EMT密切相關(guān)

STRING數(shù)據(jù)庫顯示CXCL家族與EMT相關(guān)標(biāo)志基因，包括緊密連接蛋白1(tight junction protein 1，TJP1)、CDC20樣蛋白1(CDC20-like protein 1,CDH1)、鈣粘蛋白 2(cadherin-2，CDH2)、纖連蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)、波形蛋白(vimentin，VIM)、連環(huán)蛋白β-1(catenin beta-1，CTNNB1)、扭曲相關(guān)蛋白1(twist-related protein 1，TWIST1)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子 2(snail family transcriptional repressor 2，SNAI2)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子 1(snail family transcriptional repressor 1，SNAI1)和α肌動(dòng)蛋白 2(alpha-actin-2，ACTA2)等，具有相互作用關(guān)系(圖4A)。CXCL家族與EMT標(biāo)志蛋白相關(guān)性見熱圖(圖4B)。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示CXCL8與CDH1、CDH2、SNAI1、TJP1、FN1密切相關(guān)(P<0.05)(圖4C)。

CXCL1、CXCL16、CXCL17數(shù)據(jù)提取自Wurmbach liver[27]，CXCL2提取自Chen liver[28]，CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL11、CXCL13數(shù)據(jù)提取自Mas liver[29]，CXCL5、CXCL10、CXCL12、CXCL14數(shù)據(jù)提取自Roessler liver[30]

圖2 CXCL基因在肝癌中的熱圖分析

圖3 不同CXCL趨化因子在HCC患者中的預(yù)后價(jià)值

A: CXCL家族與EMT標(biāo)志蛋白的PPI分析圖，黃色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，綠色代表無差異表達(dá)基因，紅色代表EMT標(biāo)志蛋白，連線表示基因間相互作用; B: CXCL家族與EMT的相關(guān)性熱圖; C: CXCL8與EMT標(biāo)志蛋白的相關(guān)性分析

2.4 CXCL趨化因子與HCC患者免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

CXCL家族與HCC純度的相關(guān)性見熱圖(圖5)。Xcell算法顯示CXCL家族與免疫抑制因子及免疫抑制招募因子存在明顯相關(guān)性(圖6)。TIMER數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示差異表達(dá)的CXCL趨化因子與肝癌患者免疫細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)(圖7)。其中CXCL2與中性粒細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)(P<0.05)；CXCL4(PF4)與巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)(P<0.05)；CXCL7(PPBP)僅與中性粒細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)(P<0.05)。CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14和CXCL16與所有炎癥細(xì)胞(B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)浸潤均密切相關(guān)(P<0.05)；而CXCL17僅與B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)(P<0.05)。

圖5 CXCL家族與肝癌腫瘤純度的相關(guān)性

圖6 CXCL家族與肝癌免疫因子的相關(guān)性

(續(xù)上圖)

A: CXCL2與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系;B: CXCL4與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; C: CXCL6與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; D: CXCL7與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; E: CXCL9與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; F: CXCL10與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; G: CXCL11與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; H: CXCL12與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; I: CXCL14與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; J: CXCL16與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系; K: CXCL17與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

3 討論

肝癌是惡性程度最高的消化道腫瘤之一，目前外科手術(shù)切除仍然是治療肝癌最有效的方法。但由于缺乏有效的早期診斷且病情進(jìn)展迅速，多數(shù)患者在確診時(shí)已錯(cuò)過手術(shù)最佳時(shí)間。研究表明腫瘤與腫瘤微環(huán)境間的相互作用在肝癌的進(jìn)展中具有重要作用，趨化因子通過與對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)微環(huán)境中細(xì)胞遷移和信號(hào)傳導(dǎo)[31]。作為趨化因子的重要組成部分，CXCL家族可在炎癥中誘發(fā)免疫細(xì)胞遷移，參與炎性促腫瘤微環(huán)境形成[32]。然而，目前對(duì)CXCL家族在肝癌中作用的研究報(bào)道較少，在肝癌生物學(xué)功能和預(yù)后方面尚無相關(guān)的生物信息學(xué)驗(yàn)證。本研究通過生物信息學(xué)分析表明CXCL趨化因子在肝癌的臨床治療、預(yù)后中具有潛在的標(biāo)志作用。

UNIPROT數(shù)據(jù)庫包含了癌癥研究中的大多數(shù)基因類型。本研究使用UNIPROT數(shù)據(jù)庫檢索了CXCL家族的全部成員，并使用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫評(píng)估了不同CXCL趨化因子在肝癌患者中的表達(dá)量，結(jié)果顯示HCC患者肝癌組織和正常肝臟組織中CXCL趨化因子在轉(zhuǎn)錄水平具有顯著的表達(dá)差異，其中CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10在肝癌組織中顯著高表達(dá)，CXCL2、CXCL12、CXCL14在肝癌中顯著低表達(dá)。CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL14在既往的肝癌研究中已有報(bào)道[33-35]，但其與肝癌的臨床預(yù)后是否相關(guān)仍缺乏研究支持。KMPLOT網(wǎng)站分析結(jié)果表明，CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL12高表達(dá)和CXCL6低表達(dá)的肝癌患者具有更長的生存期，因此推測(cè)其可作為判斷肝癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。

EMT是上皮細(xì)胞失去極性和連接作用而轉(zhuǎn)為間充質(zhì)表型、誘發(fā)遷移和侵襲能力增強(qiáng)的過程[36-37]，是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)為惡性表型的重要機(jī)制[38]。本課題組推測(cè)CXCL家族可能參與肝癌的EMT。本研究使用STRING、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了肝癌患者CXCL家族與EMT相關(guān)標(biāo)志基因間的相互作用及相關(guān)性程度，結(jié)果表明CXCL8是與EMT標(biāo)志基因相關(guān)性最高的趨化因子，與肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)。CXCL8(IL8)是由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在肝癌組織中一般高表達(dá)，其參與肝癌EMT已有研究報(bào)道，但具體機(jī)制仍未闡明。Yu等[39]的研究顯示，肝細(xì)胞癌中過度激活的神經(jīng)降壓素(NTS)/IL-8通路與癌細(xì)胞EMT增強(qiáng)、腫瘤微環(huán)境炎癥增多及不良預(yù)后相關(guān)。Peng等[40]證實(shí)，IL8/ERK1/2/SNAI1 和 IL-8/STAT3/TWIST1 兩種不同的信號(hào)通路參與了CXCL8誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)其遷移和侵襲的過程。同時(shí)也有研究顯示，CXCL8對(duì)多種腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生均具有直接或間接的促進(jìn)作用，如胃癌[41]、結(jié)直腸癌[42]、乳腺癌[43]、宮頸癌[44]、卵巢癌[37]等。上述研究均從機(jī)制方面證實(shí)了本研究的發(fā)現(xiàn)，即CXCL8參與肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，可將其作為判斷肝癌EMT的生物標(biāo)志物。

免疫細(xì)胞浸潤是促進(jìn)腫瘤發(fā)展的重要因素，干預(yù)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞水平的免疫治療也成了近年的研究熱點(diǎn)[45]。趨化因子與免疫細(xì)胞的遷移和定位相關(guān)，是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[46]，腫瘤微環(huán)境中趨化因子與免疫細(xì)胞的聯(lián)合干預(yù)，是近年腫瘤免疫治療的新方式。針對(duì)B細(xì)胞與T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體免疫，如PD1、PDL1和CAR-T等，是當(dāng)前腫瘤免疫治療的主要靶點(diǎn)[47-48]。已有研究證實(shí)，聯(lián)合抑制CXCL12和PD1對(duì)晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和胰腺癌有較明顯的治療效果，且安全性良好[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL趨化因子與免疫細(xì)胞浸潤存在顯著相關(guān)性，尤其是B細(xì)胞與T細(xì)胞，其中CXCL9、CXCL10、CXCL11與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性最為顯著。研究表明，CXCL9在肝癌患者以PD1/PDL1為基礎(chǔ)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中具有預(yù)測(cè)療效的作用[34]。Yan等[50]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor 1，IRF-1)通過調(diào)節(jié)CXCL10/CXCR3軸誘發(fā)HCC細(xì)胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)。CXCL11可能通過自分泌方式激活 ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的自我更新和致瘤性[51]。上述報(bào)道均佐證了本研究的發(fā)現(xiàn)，即CXCL家族不僅可作為HCC不良預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)可作為評(píng)判腫瘤免疫浸潤的重要因素，其中CXCL9、CXCL10、CXCL11是最具有潛力的免疫浸潤標(biāo)志物，可用于輔助評(píng)估肝癌的臨床治療效果。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析證實(shí)CXCL趨化因子與肝癌的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)也可以反映機(jī)體免疫狀態(tài)。其中，高表達(dá)CXCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL12和低表達(dá)CXCL6與良好的預(yù)后有關(guān)。CXCL8可作為評(píng)估肝癌患者EMT進(jìn)展的生物標(biāo)志物。CXCL9、CXCL10和CXCL11與多種免疫細(xì)胞浸潤均相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)肝癌免疫治療效果的標(biāo)志物。

本研究有一定的局限性。首先，檢索的數(shù)據(jù)庫有限，不能涵蓋肝癌相關(guān)的所有趨化因子，因此研究結(jié)果的代表性有局限。其次，生物信息學(xué)研究僅探討基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，尚不能反映機(jī)體的整體狀態(tài)，后續(xù)還需進(jìn)行體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果。

作者貢獻(xiàn)聲明

馬莉: 研究設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)檢索，數(shù)據(jù)分析，論文撰寫;楊文娟：數(shù)據(jù)檢索，數(shù)據(jù)分析；馬青梅：數(shù)據(jù)檢索，熱圖分析；馬夢(mèng)婷：數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)分析；張嬌弟：統(tǒng)計(jì)分析，圖片繪制；張倩：數(shù)據(jù)分析；劉欣躍：研究設(shè)計(jì)，論文審校。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。