王菲菲, 任秀, 李靜, 白繼超, 張聿梅, 鄭健, 崔生輝, 馬雙成

(中國食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

中藥質(zhì)量與中醫(yī)藥事業(yè)的健康發(fā)展密切相關(guān)：當(dāng)前中藥材種植環(huán)節(jié)的農(nóng)藥、重金屬超標(biāo)，采收、產(chǎn)地初加工操作不規(guī)范，中藥飲片生產(chǎn)及流通環(huán)節(jié)違法染色增重、摻雜使假，中藥材專業(yè)市場以次充好、以假充真、制假售假、違法經(jīng)營等現(xiàn)象，導(dǎo)致部分品種中藥材或飲片合格率較低[1-2]。以中藥材或飲片為原料的中成藥市場，樣品檢測合格率普遍較高。這表明中成藥的檢測水平還不能滿足監(jiān)管的需要。

2020年下旬，國家藥品監(jiān)督管理局(藥監(jiān)局)發(fā)布了“小活絡(luò)丸(大蜜丸)中異性有機(jī)物補(bǔ)充檢驗方法(BJY 202006)”和“通宣理肺丸(水蜜丸)、九味羌活丸(水丸)中水稻源性成分檢查項補(bǔ)充檢驗方法(2020年 第151號)”等系列補(bǔ)充檢驗方法，針對中成藥市場的摻偽現(xiàn)象進(jìn)行整治[3-4]。據(jù)查，A廠家生產(chǎn)的多批次中成藥制劑添加富含淀粉的非藥用植物，從而降低處方藥品投藥量，嚴(yán)重影響了中成藥市場的健康發(fā)展和人民用藥安全。筆者從藥監(jiān)局網(wǎng)站了解到，該廠家之前曾出現(xiàn)過篡改生產(chǎn)記錄的問題，并被處以收回《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GMP)證書的處罰。由此可見，A廠家少投原材料的問題一直存在。在中成藥檢測中，利用淀粉類非藥用植物替代中藥材投料的檢測方法還不完善，這也給了部分廠家可乘之機(jī)。

由于中成藥成分復(fù)雜，檢測手段長期停留在對個別藥材或飲片的鑒別及含量測定上[5]，早已不能滿足中藥現(xiàn)代化監(jiān)管的需求。九味羌活丸(水丸)和香砂養(yǎng)胃丸(水丸)是市場上常見的中成藥制劑，都具有劑型多應(yīng)用廣的特點(diǎn)[6-9]。相關(guān)制劑在《中國藥典》2020年版一部處方和四部制劑通則中均沒有摻入米粉的加工工藝[10]。為了進(jìn)一步提高摻偽檢測方法的靈敏性和準(zhǔn)確性，本文在已建立的(普通)PCR方法檢查“水稻源性成分檢查項補(bǔ)充檢驗方法”的基礎(chǔ)上，研究制定了熒光探針PCR方法，以期為中成藥摻偽的快速檢測提供技術(shù)儲備。

DNA分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，攜帶動植物的遺傳標(biāo)簽，是中藥鑒定中理想的生物標(biāo)志物[11]。自2010年以來，《中國藥典》陸續(xù)收錄了多個品種中藥材或飲片的(普通)PCR的定性檢查方法。(普通)PCR方法操作較簡便，但不能監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、不能對待測樣品進(jìn)行定量/半定量分析，且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，特別對于成分復(fù)雜的中成藥制劑，假陽性結(jié)果較難排除。在普通PCR方法基礎(chǔ)上發(fā)展的熒光探針PCR技術(shù)，可以更為準(zhǔn)確地對目的基因進(jìn)行篩查。它是在PCR擴(kuò)增時與引物一同加入1個特異性的熒光探針寡核苷酸，與PCR產(chǎn)物互補(bǔ)產(chǎn)生化學(xué)熒光。熒光探針技術(shù)具有特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽性率低等特點(diǎn)[12]，是中成藥成分鑒定、摻偽、摻假的有效檢查方法。

本研究從全國各地收集了A廠家的市售樣品以及其他廠家樣品共計13批次，擬建立熒光探針PCR方法，準(zhǔn)確快速地篩查九味羌活丸和香砂養(yǎng)胃丸中米粉摻偽的樣品，以期為中成藥檢測標(biāo)準(zhǔn)化體系提供技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CFX96 Touch 熒光定量 PCR 檢測系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；梯度 PCR儀(美國ABI公司)；EPS-301電泳儀(美國Amersham公司)；DHG-9075A 干烤箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；XS105 十萬分之一電子分析天平 (瑞士Mettler Toledo公司)；FA2004B 萬分之一 電子分析天平 (上海越平科學(xué)儀器有限公司); Milli-Q 超純水儀 (美國Millipore公司)；Eppendorf MiniSpin離心機(jī)、Centrifuge 518R離心機(jī)、移液槍(10～1000 μL)(美國Eppendorf公司)；MM400球磨儀(德國Retsch公司)；微量紫外分光光度計 Nano Vue plus (通用電氣醫(yī)療集團(tuán))；全自動凝膠成像系統(tǒng) Gel Doc XR+(美國Bio-rad公司)。

1.2 試劑與樣品

(1)試劑 植物DNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司，上下游引物、探針由Invtrogen公司合成(表1)，TE緩沖溶液、Taq DNA 聚合酶、dNTP、TAE電泳緩沖液、瓊脂糖及PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購自生物工程(上海)有限公司，肉制品核酸提取試劑盒、10×PCR buffer和DL 500 DNA marker購自Takara公司。

表1 實驗用引物探針和退火溫度匯總表Table 1 The primer sequences and annealing temperature

(2)樣品 本研究收集了來源于5個地區(qū)7個廠家13批次98份樣品(為供試樣品)，收集了來自北京市售的10批次大米樣品(為陽性對照)。

①陰性樣品 九味羌活丸陰性樣品： 龍膽(批號121530-201602)、柴胡(批號120992-201509)、黃芩(批號120955-201810)、梔子(批號120986-201610)、澤瀉(批號121081-201807)、車前子(批號121628-201702)、當(dāng)歸(批號120927-201617)、地黃(批號121180-201506)和甘草(批號120904-202021)。香砂養(yǎng)胃丸陰性樣品:木香(批號120921-201309)、砂仁(批號120985-201406)、白術(shù)(批號120925-202013)、陳皮(批號120969-202011)、 茯苓(批號121117-201910)、半夏(批號121272-201806)、香附(批號121059-201808)、枳實(批號120936-201606)、豆蔻(肉豆蔻 批號 120926-201608)、厚樸(批號121285-201303)、廣藿香(批號121135-201606)、甘草(批號120904-202021)和大棗(批號121040-201809)，見表2。

②特異性樣品 大麥若葉、多脈蕓香草、麥芽、蘆根、天竺黃、薏苡仁、小麥、燕麥、糙米、糯米、紫米、紫米、狗尾草、馬唐和牛筋草共15份禾本科植物樣品，均由中國食品藥品檢定研究院張南平副研究員提供并鑒定。上述全部藥材經(jīng)ITS2引物克隆測序，基因序列與National center for biotechnology information(NCBI)數(shù)據(jù)庫比對。

表2 九味羌活丸和香砂養(yǎng)胃丸樣品信息Table 2 Sample information of Jiuwei Qianghuo Wan and Xiangsha Yangwei Wan

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備和樣品DNA的提取

(1)供試樣品 取九味羌活丸或香砂養(yǎng)胃丸適量，粉碎，稱取10 g，加入50 mL 65 ℃預(yù)熱的TE緩沖溶液(pH 8.0)，65 ℃水浴振搖至完全分散，立即吸取0.5 mL混懸液至2 mL離心管中。按試劑盒說明書，加入裂解液繼續(xù)提取，直至DNA提取完成，儲存于-20 ℃?zhèn)溆茫峦?/p>

(2)陰性樣品 按《中國藥典》2020年版一部九味羌活丸和香砂養(yǎng)胃丸處方配置，混合均勻。將陰性樣品稱取10 g，加入50 mL 65 ℃預(yù)熱的TE緩沖溶液，65 ℃水浴振搖至完全分散，立即吸取0.5 mL混懸液至2 mL離心管中，提取DNA，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)空白對照 取0.5 mL的無菌TE緩沖溶液至2mL離心管中，提取DNA，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)陽性對照 取市售大米10批次分別磨碎，各稱取10 g，加入50 mL 65 ℃預(yù)熱的TE緩沖溶液，65 ℃水浴振搖至完全分散，立即吸取0.5 mL混懸液至2 mL離心管中，提取DNA，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)實驗樣品制備方法 制備上述供試樣品、陰性樣品、特異性樣品、陽性對照和空白對照，每批次樣品提取3份，共計123份。精密度和重復(fù)性樣品24份(各12份)，總計147份。采用紫外分光光度計檢測，提取DNA模板在D260/280均在1.8～2.2之間，測得DNA質(zhì)量濃度在10 ～ 50 ng/μL之間。提取米粉和15份特異性樣品基因組，使用ITS2通用引物擴(kuò)增，并經(jīng)克隆測序確認(rèn)，基原正確(表3)。

2.2 PCR反應(yīng)條件

(1)普通PCR方法 25 μL PCR反應(yīng)體系包括：2×PCR預(yù)混液(包含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液等)12.5 μL，鑒別引物(濃度為50 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA溶液2 μL，無菌超純水10.1 μL。每個樣品設(shè)置2個平行。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)反應(yīng)40次(95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。電泳檢測膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試樣品、陰性樣品、陽性對照和空白對照溶液的上樣量分別為10～20 μL，DL500 DNA分子量標(biāo)記物上樣量為5 μL。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。

(2)熒光探針PCR方法 25 μL PCR反應(yīng)體系包括：2.5 μL 10×PCR 緩沖液，1 μL dNTP、上下游引物各0.2 μL(濃度為50 μmol/L)，0.25 μL探針，0.2 μL Taq DNA 聚合酶，2 μL模板DNA溶液，18.45 μL無菌超純水。每個樣品設(shè)置2個平行。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)反應(yīng)40次[95 ℃ 30 s，60～63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(FAM通道收集熒光信號)]，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

2.3 克隆測序

使用PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，將PCR特征條帶克隆到T載體上，用Sanger法進(jìn)行序列測定，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。特異性樣品檢索結(jié)果如表3所示。九味羌活丸(水丸)和香砂養(yǎng)胃丸(水丸)供試樣品比對，結(jié)果如表4所示。

表3 大米探針Ⅲ的特異性分析Table 3 Rice primers and probe Ⅲ specificity test

2.4 引物生物信息學(xué)驗證

使用NCBI中“Primer-BLAST”(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)功能，對Ⅰ-Ⅲ號引物和TaqMan探針序列進(jìn)行驗證。經(jīng)檢索，3組引物和探針序列匹配最優(yōu)均為水稻基因(OryzasativaL.)。在匹配結(jié)果前3位的分析中，3組引物和探針僅與水稻基因匹配。

表4 九味羌活丸和香砂養(yǎng)胃丸樣品信息Table 4 Sample information of Jiuwei Qianghuo Wan and Xiangsha Yangwei Wan

2.5 米粉引物和探針的適用性篩選

實驗將檢索得到的3組引物和探針，進(jìn)行適用性研究，以尋找適用于本研究的引物和探針。分別選擇A廠家供試樣品、陰性樣品、陽性對照和空白對照作為模板，考察引物和探針的特異性。供試樣品在第Ⅰ和Ⅱ組引物和探針參與的反應(yīng)中，無擴(kuò)增曲線(圖1)。第Ⅲ組引物和探針參與可有效檢測出供試樣品和米粉樣品熒光信號，且呈現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線；陰性樣品和空白對照無Ct值檢出。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳驗示：在第Ⅰ組引物和探針參與的反應(yīng)中，個別供試樣品與陽性對照大小一致的擴(kuò)增條帶；在第Ⅱ組引物和探針參與的反應(yīng)中，每組供試樣品都可擴(kuò)增出多條雜帶；在第Ⅲ組引物和探針參與的反應(yīng)中，供試樣品可檢出與陽性對照大小一致的擴(kuò)增條帶。因此，本試驗選擇第Ⅲ組進(jìn)行下一步研究。

圖1 米粉特異性引物在九味羌活丸試驗的擴(kuò)增曲線(①探針 Ⅲ, ②探針Ⅰ 和 Ⅱ)Figure 1 Specific rice amplification curve of rice in Jiuwei Qianghuo Wan(① primer Ⅲ, ② prime Ⅰ and Ⅱ)

2.6 方法學(xué)考察

實驗參考《中國藥典》2020年版四部分析方法驗證指導(dǎo)原則(9101)，對實驗的方法學(xué)進(jìn)行驗證[10]。

(1)特異性 取空白對照、陰性樣品和陽性對照進(jìn)行試驗，計算樣品的Ct值。實驗分析了15種特異性樣品，與陽性對照Ct值進(jìn)行比較，可檢出糙米、糯米和紫米等稻屬植物的Ct值信號，經(jīng)克隆測序比對結(jié)果均為水稻(OryzasativaL.)，而其他12種禾本科植物無擴(kuò)增信號。

(2)檢出限 將10 g陰性樣品中加入質(zhì)量比為1/10，1/100，1/1 000和1/10 000的米粉，按“供試樣品制備”方法制備樣品，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并采集熒光信號。實驗的檢出限為每克樣品中可檢出0.001 g米粉。

(3)重復(fù)性 各取1批次A廠家的供試樣品，按“供試樣品制備”方法平行制備6份，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光采集，計算樣品Ct值。九味羌活丸重復(fù)性的Ct值為29.88，RSD為1.98%；香砂養(yǎng)胃丸重復(fù)性的Ct值為35.09，RSD為2.11%。

(4)精密度 取上述制備的重復(fù)性樣品1份，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算樣品Ct值。九味羌活丸精密度的Ct值為30.34，RSD為1.23%；香砂養(yǎng)胃丸精密度的Ct值為35.43，RSD為2.63%。由此可見，九味羌活丸和香砂養(yǎng)胃丸的重復(fù)性和精密度良好。

2.7 市售樣品檢測結(jié)果

按上述方法對市售樣品進(jìn)行檢測，檢出A廠家的5批次九味羌活丸和2批次香砂養(yǎng)胃丸摻入米粉。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，其序列與水稻(OryzasativaL.)序列的匹配(匹配度為100%)，其他批次樣品未檢出米粉(水稻)信號。

3 討論

3.1 方法學(xué)驗證

在“樣品的制備和樣品DNA的提取”中，試驗將“DNA提取試劑盒”說明書推薦的樣品取樣量(30～100 mg)增加到10 g，修改為將10 g樣品完全溶解于50 mL 預(yù)熱的TE緩沖液中，吸取懸濁液進(jìn)行DNA提取，按說明書繼續(xù)提取。試驗加大了取樣量，使得取樣更具有代表性，降低了漏檢率。本研究通過文獻(xiàn)檢索和生物信息學(xué)比對，驗證檢索得到的3組引物和探針，結(jié)果顯示引物和探針基因片段在水稻基因組中廣泛分布：Osi引物(I號)來源于水稻線粒體泛醌氧化酶的基因參與植物呼吸作用[16-17]。Orb引物(Ⅱ號)來源于水稻的β支鏈淀粉，分布于水稻的胚芽或種子之中。Org引物(Ⅲ號)是水稻內(nèi)源性基因GOS 9的片段[18]。

3.2 分析條件設(shè)定和結(jié)果判定

由于目前中藥檢測中還沒有針對熒光探針PCR方法制定的標(biāo)準(zhǔn)，本文根據(jù)上述研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合顯微鑒定、普通PCR檢測方法和基因測序的結(jié)果分析，參照生物學(xué)和食品科學(xué)中關(guān)于熒光探針PCR方法相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[19-21]，擬定“九味羌活丸(水丸)和香砂養(yǎng)胃丸(水丸)中摻偽米粉熒光探針PCR檢測方法”，內(nèi)容如下。

3.2.1 閾值設(shè)定

綜合分析儀器給出的各項結(jié)果，基線以儀器給出的默認(rèn)值作為參考，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，具體還需根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整，選擇反應(yīng)所設(shè)定的熒光基因?qū)?yīng)的通道(FAM)及進(jìn)行分析。

3.2.2 質(zhì)控

陰性對照和空白對照應(yīng)無Ct值，陽性對照的Ct值應(yīng)不超過30.0，且呈現(xiàn)S型典型擴(kuò)增曲線。否則，此次實驗視為無效。

3.2.3 熒光探針PCR結(jié)果分析及判定

陰性反應(yīng)結(jié)果判定：檢測結(jié)果無Ct值、無擴(kuò)增曲線或反應(yīng)曲線無明顯對數(shù)增長期，判定為熒光探針PCR陰性反應(yīng)。

陽性反應(yīng)結(jié)果判定：檢測結(jié)果Ct值不超過35.0，且擴(kuò)增曲線有明顯的對數(shù)增長曲線，判定為熒光探針PCR陽性反應(yīng)。

對于Ct值在(35.0,40.0)的樣品，應(yīng)重新取樣進(jìn)行重復(fù)檢測。如果重復(fù)檢測的Ct值在(35.0，40.0)之間，判為熒光探針PCR陰性反應(yīng)。

3.3 供試樣品污染米粉的判定

米粉沒有收錄在《中國藥典》第四部輔料品種之中，但是糊丸的加工工藝中可作為藥用黏合劑進(jìn)行應(yīng)用[10]。本研究考慮到中成藥生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)過程中，可能存在少量米粉污染的現(xiàn)象，故在參考食品和生物制品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對中成藥摻偽米粉的檢測限度進(jìn)行了限定。

試驗中九味羌活丸和香砂養(yǎng)胃丸有部分樣品Ct值>35.0，通過克隆測序確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為米粉。但是，本研究考慮到原樣品中米粉基因組含量較少，故將該樣品結(jié)果判定為陰性。按本研究“3.2.3”判定標(biāo)準(zhǔn)，通過重復(fù)試驗驗證，Ct值依然在(35.0，40.0)之間的結(jié)果判定為陰性結(jié)果，因此九味羌活丸(3號，Ct=37.18)和香砂養(yǎng)胃丸(10-11號，Ct=35.77，36.41)樣品結(jié)果判定為陰性。需要指出的是，本研究在市場上收集的其他廠家的3批次九味羌活丸和2批次香砂養(yǎng)胃丸均未檢出米粉成分，表明A廠家摻偽米粉的行為是孤立的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究收集了市售的5個地區(qū)7個廠家13批次98份九味羌活丸(水丸)和香砂養(yǎng)胃丸(水丸)樣品，建立了熒光探針定量PCR的方法，制定了判定標(biāo)準(zhǔn)，確定了4批次來自A廠家的九味羌活丸樣品中添加了米粉。通過對反應(yīng)的監(jiān)測和Ct值的分析，排除了可能污染米粉的供試樣品，為熒光探針PCR方法在中成藥摻偽檢測的結(jié)果判定提供了參考。

作者貢獻(xiàn)聲明

崔生輝、鄭健、馬雙成:提出研究思路和框架, 修改論文;王菲菲、任秀:實驗設(shè)計、整理數(shù)據(jù)和撰寫論文;李靜、白繼超、張聿梅:參與實驗的完成，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和結(jié)果判定研究

利益沖突聲明

本研究未受企業(yè)、公司等第三方資助, 不存在潛在利益沖突