郭志利，左曉琦，張 梅，康秉南，姚玉英

(1. 石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 石家莊 050599；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000;3. 石家莊科技信息職業(yè)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

糖尿病作為一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)慢性病，需要患者長(zhǎng)期服藥并定期門診隨訪調(diào)節(jié)藥物劑量，由于患者依從性差或其他原因?qū)е卵强刂撇患?，往往容易誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥。2型糖尿病作用的靶器官包括心、腦、視網(wǎng)膜、腎臟等，同時(shí)該病可以增加感染風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致患者后期致殘或器官衰竭。目前2型糖尿病治療包括飲食運(yùn)動(dòng)控制、二甲雙胍口服、胰島素注射等[1]，中醫(yī)藥的應(yīng)用也逐漸普及。該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中一種機(jī)制是患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌異常導(dǎo)致炎癥因子大量產(chǎn)生而作用于正常胰島細(xì)胞，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[2-3]。黃連是解毒清熱中藥，其提取物小檗堿具有降低患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察了黃連對(duì)高脂加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)炎癥因子的影響，旨在進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雌性SD大鼠110只，鼠齡5周左右，體重(440±6.8)g，由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-001。所有大鼠于層流架內(nèi)分籠飼養(yǎng)，專人負(fù)責(zé)管理。實(shí)驗(yàn)室定期消毒，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑 檸檬酸及檸檬酸鈉購(gòu)于山東省中創(chuàng)檸檬生化有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。小檗堿注射液(規(guī)格：10 mL/支)購(gòu)于山東優(yōu)維藥業(yè)有限公司；血清胰島素ELISA試劑盒購(gòu)于欣博盛生物有限公司；TRIzol 購(gòu)于Thermo Fisher公司；即用型PBS粉劑購(gòu)于武漢谷歌生物科技有限公司；熒光定量RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于武漢基因美生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、干擾素-γ(IFN-γ)qPCR引物購(gòu)于上海杏園瑞民生物工程有限公司。

1.3主要儀器 MH550冰凍切片機(jī)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；RT-2100C自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)雷杜公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)于貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司；組織搗碎勻漿機(jī)購(gòu)于天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于香港力新發(fā)展有限公司；快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)于廣州華峰生物科技有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將所有大鼠進(jìn)行編號(hào)，先正常飼養(yǎng)1周讓大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。采用隨機(jī)數(shù)法選取25只大鼠作為正常組，給予常規(guī)大鼠飼料喂養(yǎng)；其余大鼠均給予自制高脂高糖飼料(基礎(chǔ)飼料57.5%+蔗糖20%+豬油18%+膽酸鈉0.5%+膽固醇4%)喂養(yǎng)。4周后，所有大鼠均禁食但不禁水12 h，隨后高脂高糖喂養(yǎng)大鼠腹腔內(nèi)注射STZ 60 mg/kg(臨用前溶解在pH 4.2的0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液內(nèi))，正常組大鼠腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射72 h和1周后，大鼠尾靜脈取血，測(cè)定空腹血糖(FPG)，2次FPG均≥16.7 mmol/L則表示造模成功。篩選造模成功大鼠75只，隨機(jī)分為模型組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組，每組25只。小檗堿低、高劑量組分別給予0.125 mg/g和0.375 mg/g的小檗堿注射液(溶于5 mL生理鹽水中)灌胃，正常組和模型組相同時(shí)間給予等體積的生理鹽水灌胃，均1次/d，干預(yù)期間常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1FPG和空腹胰島素(FINS)水平 分別于灌胃2，4，6，8，12周后，每組隨機(jī)取5只大鼠，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，腹主動(dòng)脈取血3 mL，室溫靜置2 h，4 ℃下3 000 r/min離心(離心半徑13.5 cm)5 min，分離血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)FPG水平，采用ELISA法檢測(cè)FINS水平。

1.5.2脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比 取血完畢后，沿著大鼠腹正中線切開，找到脾臟，分離取出。脾臟用生理鹽水清洗后置于4%多聚甲醛內(nèi)固定6 h，后依次放在裝有20%和30%乙醇的瓶?jī)?nèi)脫水。脫水后用石蠟常規(guī)包埋，并使用聚乙二醇浸潤(rùn)，將其置于恒冷箱中，然后進(jìn)行冠狀面切片，厚度5 μm。每組大鼠隨機(jī)取25片切片，碾碎成粉末狀，隨后加入EDTA抗凝。并在4 ℃環(huán)境下，以3 000 r/min離心(離心半徑13.5 cm)5 min取上清液，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比。

1.5.3脾臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β mRNA表達(dá)量 利用Real-time PCR 方法檢測(cè)：從恒冷箱中取出灌胃2，4，6，8，12周后各組大鼠脾臟組織切片，每組25片，碾碎成粉末狀，隨后加入1 mL TRIzol溶液混勻。并在低溫環(huán)境下，以8 000 r/min離心(離心半徑13.5 cm)6 min取上清液，加入新的離心管中，然后使用氯仿、異丙醇處理2次，再次8 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心6 min，使用乙醇洗滌多余液體，獲得RNA樣品。此樣品中加入DNA清洗液，去除多余DNA，然后使用反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA樣品。將樣品分別與TNF-α、IFN-γ和IL-1β引物進(jìn)行作用，PCR反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃下30 s使其變性，60 ℃退火，再90 ℃下使其延伸，通過(guò)Poly core軟件，對(duì)其循環(huán)數(shù)進(jìn)行計(jì)算，獲得TNF-α、INF-γ和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清FPG、FINS水平比較 與同時(shí)間段正常組比較，模型組大鼠灌胃2，4，6，8，12周后血清FPG水平均顯著升高，F(xiàn)INS水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與同時(shí)間段模型組比較，小檗堿低、高劑量組大鼠灌胃2，4，6，8，12周后血清FPG水平均顯著降低,PINS水平均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與同時(shí)間段小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組6，8，12周后血清FPG水平均更低，F(xiàn)INS水平均更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，2組大鼠灌胃2，4周后血清FPG、FINS水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1及表2。

表1 正常組和2型糖尿病各組大鼠血清FPG水平比較

2.2各組大鼠脾臟組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比比較模型組大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比均顯著低于同時(shí)間段正常組(P均<0.05)；小檗堿低、高劑量組大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比均顯著高于同時(shí)間段模型組(P均<0.05)；小檗堿高劑量組大鼠灌胃6，8，12周后脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比均顯著高于同時(shí)間段小檗堿低劑量組(P均<0.05)，2組大鼠灌胃2，4周后脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 正常組和2型糖尿病各組大鼠血清FINS水平比較

表3 正常組和2型糖尿病各組大鼠脾臟組織中CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比比較

2.3各組大鼠脾臟組織中炎癥因子mRNA表達(dá)量比較 模型組大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾臟組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于同時(shí)間段正常組(P均<0.05)；小檗堿低、高劑量組大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾臟組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于同時(shí)間段模型組(P均<0.05)；小檗堿高劑量組大鼠灌胃6，8，12周后脾臟組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于同時(shí)間段小檗堿低劑量組(P均<0.05)，2組大鼠灌胃2，4周后脾臟組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表4～6。

3 討 論

表4 正常組和2型糖尿病各組大鼠脾臟組織中TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表5 正常組和2型糖尿病各組大鼠脾臟組織中IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表6 正常組和2型糖尿病各組大鼠脾臟組織中IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

中醫(yī)認(rèn)為2型糖尿病及其并發(fā)癥歸于“消渴”“消癉”等范疇，患者多以陰津虧損、陰虛為本，燥熱偏盛為標(biāo)，標(biāo)本相輔相成，并有血瘀貫穿[5]。中醫(yī)治宜清熱潤(rùn)燥、養(yǎng)陰生津、活血化瘀等。黃連性寒，味苦，歸脾經(jīng)、大腸經(jīng)，屬于清熱燥濕藥，其主要有效成分為小檗堿，小檗堿進(jìn)入機(jī)體后激活G蛋白耦聯(lián)受體，進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，從而使G蛋白-AC通路介導(dǎo)蛋白激酶A( PKA)活化，PKA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝[6]。故本實(shí)驗(yàn)選用小檗堿注射液作為實(shí)驗(yàn)用藥。

2型糖尿病是臨床上最常見(jiàn)的一種糖尿病類型，占糖尿病患者總數(shù)的90%左右[7]。2型糖尿病的發(fā)病因素有很多，但肥胖是關(guān)鍵元兇，尤其是中心性肥胖。過(guò)量的高脂飲食導(dǎo)致脂肪異位堆積阻礙正常細(xì)胞的氧化代謝，降低胰島素的敏感性，啟動(dòng)胰島素抵抗，加重機(jī)體糖脂代謝紊亂[8-9]。目前研究認(rèn)為，高脂高糖聯(lián)合STZ共同誘導(dǎo)建立的2型糖尿病大鼠模型與人類2型糖尿病發(fā)病模式最符合[10]，所以本實(shí)驗(yàn)采用該方法建模。

目前研究證實(shí)，2型糖尿病患者體內(nèi)呈慢性炎癥狀態(tài)，機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答異常[11]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞是非特異性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，其表達(dá)異常會(huì)使M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，引起CD8+T細(xì)胞增加，作用于脂肪組織中的脂肪細(xì)胞分泌炎癥因子，損傷胰島細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌異常，血糖升高；上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞表達(dá)，其可通過(guò)抑制Th1型細(xì)胞因子分泌及分泌IL-10等細(xì)胞因子,抑制炎癥反應(yīng)，改善胰島分泌功能[12-14]。既往研究證實(shí)，2型糖尿病大鼠血清中炎性因子TNF-α、INF-γ、IL-1β水平會(huì)升高[15]，但是這些因子在血清中的表達(dá)量易被血清中其他物質(zhì)干擾導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)，所以本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了大鼠脾臟組織中TNF-α、INF-γ、IL-1β的mRNA表達(dá)量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著小檗堿灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，小檗堿低、高劑量組FPG水平及脾臟組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，F(xiàn)INS水平及脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比均呈上升趨勢(shì)，同時(shí)灌胃6周、8周、12周后小檗堿高劑量組FPG水平及脾臟組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表達(dá)量均顯著低于同時(shí)間段小檗堿低劑量組，F(xiàn)INS水平及脾臟組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占比均顯著高于同時(shí)間段小檗堿低劑量組。說(shuō)明小檗堿可以明顯降低高脂加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠血糖水平，升高血清胰島素水平，機(jī)制可能與上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞表達(dá)，下調(diào)炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-1β表達(dá)有關(guān)，且這種作用與小檗堿劑量及應(yīng)用時(shí)間有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。