齊璐瑤，邢基祥，范吉林，侯信錚，張世亮

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

室性早搏(premature ventricular beats，PVBs)是指竇房結(jié)發(fā)出的激動未抵達(dá)之前，心室其他起搏點(diǎn)提早興奮，使心室發(fā)生除極化過程，屬于心律失常的范疇[1]。其癥狀多表現(xiàn)為心悸、“停搏”感、胸悶、摸脈時(shí)有間歇，也可見無異常表現(xiàn)者。若早搏較少則不需要特殊處理，心悸產(chǎn)生焦慮時(shí)可予以一定的安撫或治療；若發(fā)生多源性室性早搏或短陣室速明顯影響心排血量時(shí)，癥狀更加顯著，則需規(guī)范治療。常見的病因有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等器質(zhì)性心臟病、自主神經(jīng)功能紊亂、左室內(nèi)假腱索、電解質(zhì)失衡以及藥物等。本病臨床常見，據(jù)統(tǒng)計(jì)75歲以上人群中發(fā)病率達(dá)69%[2]。西藥治療本病時(shí)常有致心律失常的局限性。參蛭通心膠囊是筆者導(dǎo)師張世亮依據(jù)多年診療經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立的治療氣虛血瘀型室性早搏的代表方，主要由人參、水蛭、三七、丹參、川芎、麥冬、冰片七味藥材配伍而成，臨床試驗(yàn)證實(shí)其在改善普通心電圖和24 h動態(tài)心電圖方面有效率(72.4%)遠(yuǎn)高于長效倍他樂克(44.8%)，室性早搏的削減數(shù)量非?？捎^[3]。長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)該藥療效確切，不但能顯著減少室性早搏發(fā)作的頻次和縮短每次持續(xù)的時(shí)間，而且對靶器官也有一定的保護(hù)效果[3-4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用藥物與系統(tǒng)生物學(xué)相結(jié)合的形式，分析藥物與疾病、靶點(diǎn)之間存在的復(fù)雜多樣的協(xié)同作用關(guān)系[5]，其借助大數(shù)據(jù)平臺系統(tǒng)、綜合的特點(diǎn)，推動整體、辨證的中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的過程。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，旨在解析參蛭通心膠囊治療室性早搏的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1參蛭通心膠囊有效成分與靶點(diǎn)的獲取 參蛭通心膠囊各種有效成分的收集來源于TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫。對于TCMSP收錄的人參、三七、丹參、川芎、冰片等，設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18，得到其潛在有效成分，進(jìn)而預(yù)測其作用靶點(diǎn)；對于TCMSP未收錄的水蛭、麥冬等藥物，可通過BATMAN-TCM查找其活性成分，進(jìn)而預(yù)測其相關(guān)靶點(diǎn)。而后把參蛭通心膠囊得到的所有潛在靶點(diǎn)統(tǒng)一導(dǎo)入U(xiǎn)niprot(https://www.uniprot.org/) 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步規(guī)范地處理基因。

1.2室性早搏已知靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中，檢索關(guān)鍵詞“premature ventricular beats”，將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)而獲得室性早搏在人體內(nèi)的靶基因。

1.3參蛭通心膠囊治療室性早搏靶點(diǎn)的獲取 運(yùn)用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平臺，將參蛭通心膠囊潛在靶點(diǎn)與室性早搏已知靶點(diǎn)導(dǎo)入，圖形重疊區(qū)域就是參蛭通心膠囊治療室性早搏的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4“參蛭通心膠囊-成分-室性早搏-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將參蛭通心膠囊所含活性成分與藥物-室性早搏的共同靶點(diǎn)一同導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“參蛭通心膠囊-成分-室性早搏-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5疾病-藥物蛋白互作(PPI)可視化網(wǎng)絡(luò)圖與核心靶點(diǎn)圖的制作 在STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入?yún)Ⅱ瓮ㄐ哪z囊-室性早搏的交集靶點(diǎn)，限制物種為“人”(Homo sapiens)，規(guī)定交互分?jǐn)?shù)最低值>0.4，由此建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。向Cytoscape3.7.2中導(dǎo)入結(jié)果，選取大于平均Degree值的靶點(diǎn)建立核心靶點(diǎn)圖。

1.6GO功能與KEGG通路富集分析 利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov)數(shù)據(jù)庫，將整合的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入，以“PValue、FDR均<0.05”為前提篩選，獲取參蛭通心膠囊治療室性早搏的GO分析結(jié)果。而后，將篩選獲取的數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平臺，制作BP、CC、MF三合一柱狀圖。同時(shí)運(yùn)用R語言軟件，將gene symbol對應(yīng)的id導(dǎo)入運(yùn)行，得到KEGG通路富集分析的氣泡圖和主要通路的作用路徑示意圖，推測參蛭通心膠囊治療室性早搏的作用機(jī)制。

1.7參蛭通心膠囊治療室性早搏的核心靶點(diǎn)及主要成分的分子對接 依據(jù)核心靶點(diǎn)圖選取出較為關(guān)鍵的核心靶點(diǎn)，找到這些核心靶點(diǎn)對應(yīng)參蛭通心膠囊的主要成分，而后一一進(jìn)行驗(yàn)證。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站檢索所需小分子配體的二維結(jié)構(gòu)，利用Chem3D將其轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)。在PDB(https://www.rcsb.org/)網(wǎng)站搜索大分子受體的3D模型，運(yùn)用PyMOL去水、去小分子。利用AutoDockTools生成小分子配體和大分子受體的最終格式。運(yùn)用命令提示符的命令計(jì)算出兩者一一對應(yīng)的結(jié)合能。而后選取結(jié)合能最小的六對，在PyMOL軟件中進(jìn)行分子對接。

2 結(jié) 果

2.1參蛭通心膠囊有效成分篩選結(jié)果 利用TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索參蛭通心膠囊的7種中藥組成，通過OB≥30%，DL≥0.18或刪除重復(fù)項(xiàng)等步驟進(jìn)行整合，篩選得到人參22個(gè)、冰片3個(gè)、川芎7個(gè)、丹參65個(gè)、三七8個(gè)、水蛭13個(gè)、麥冬18個(gè)，共計(jì)136個(gè)潛在有效成分，見表1及表2。

表1 TCMSP人參、冰片、川芎、丹參、三七的活性成分

續(xù)表

續(xù)表

表2 BATMAN-TCM水蛭、麥冬的活性成分

2.2參蛭通心膠囊治療室性早搏靶點(diǎn)的獲取 參蛭通心膠囊的136個(gè)潛在有效成分共對應(yīng)到人類相關(guān)基因靶點(diǎn)630個(gè)，同時(shí)，室性早搏的靶點(diǎn)共有1 189個(gè)，利用Venn圖得到參蛭通心膠囊與室性早搏的共同靶點(diǎn)193個(gè)，即為參蛭通心膠囊治療室性早搏的靶點(diǎn)，見圖1。

2.3參蛭通心膠囊有效成分及與藥物-室性早搏對應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 Cytoscape3.7.2軟件可構(gòu)建“參蛭通心膠囊-成分-室性早搏-靶點(diǎn)圖”，見圖 2。在圖中，周圍各色的扁圓形表示參蛭通心膠囊涵蓋的各種成分，中央的長方形表示靶點(diǎn)基因，菱形代表參蛭通心膠囊的7種中藥組成和室性早搏的名稱；若有成分或靶點(diǎn)重復(fù)者則僅顯示一次。由圖可見各藥物、成分、疾病、靶點(diǎn)之間錯綜復(fù)雜而又密切的聯(lián)系。

圖1 參蛭通心膠囊-室性早搏藥物-疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)圖的制作 STRING數(shù)據(jù)庫可以獲取參蛭通心膠囊-室性早搏的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，規(guī)定交互分?jǐn)?shù)最低值>0.4，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，其余設(shè)定均為默認(rèn)值，結(jié)果見圖3。圖中共有193個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 611條邊，Degree的平均值為27.1。可見參與此過程的蛋白質(zhì)之多與蛋白質(zhì)之間作用的復(fù)雜性、多樣性。為了創(chuàng)建明確的核心靶點(diǎn)圖，將STRING的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｔ谄骄鵇egree為27.1的情況下，以Degree大于28為條件篩選核心靶點(diǎn)，得出核心靶點(diǎn)圖，見圖 4。圖中圓越大代表Degree值越高，則越有可能是參蛭通心膠囊治療室性早搏的核心作用靶點(diǎn)。這些核心靶點(diǎn)主要有INS、ALB、IL6、AKT1、VEGFA、TNF、NOS3等。

2.5GO功能與KEGG通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對參蛭通心膠囊與室性早搏的共同靶點(diǎn)做GO富集分析。GO分析主要包括BP-生物學(xué)過程，CC-細(xì)胞定位和MF-分子功能分析。三者均以“PValue、FDR均<0.05”為條件篩選后，各選取富集基因數(shù)最多的前9條結(jié)果，利用微生信平臺，制作BP，CC，MF三合一柱狀圖，則可直觀展現(xiàn)GO分析的各項(xiàng)結(jié)果，見圖 5。KEGG通路富集分析通過R語言運(yùn)行得出氣泡圖，見圖6。信號通路主要包括Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、cAMP signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、MAPK signaling pathway等。選取靶點(diǎn)富集數(shù)目較多且核心靶點(diǎn)富集的、qvalue值較小的3個(gè)路徑繪制示意圖，見圖7～9。

2.6參蛭通心膠囊治療室性早搏的核心靶點(diǎn)及主要成分的分子對接結(jié)果 關(guān)鍵的核心靶點(diǎn)、與主要化合物成分的對應(yīng)關(guān)系以及相應(yīng)的結(jié)合能見表3。當(dāng)結(jié)合能<-5.0 kcal/mol時(shí)[6]，配體與受體結(jié)合相對穩(wěn)定，隨著結(jié)合能減小，結(jié)合性會更好。選取表3中結(jié)合能最小的6組配體與受體繪制分子對接示意圖，見圖10。

圖2 參蛭通心膠囊-室性早搏藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 參蛭通心膠囊-室性早搏藥物-疾病交集靶點(diǎn)互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

室性早搏可歸類于中醫(yī)學(xué)中“心悸”“怔忡”，古籍中早有關(guān)于其證候的描述，如《內(nèi)經(jīng)》中提到“參伍不調(diào)者病”以及“予之短期者，乍數(shù)乍疏也”等。綜合歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)，此病多屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，為臟腑氣血陰陽虧虛的基礎(chǔ)上兼夾痰、瘀、火等實(shí)邪，使得心神失寧，心脈不暢，心之氣血陰陽不相順接而致“脈結(jié)代，心動悸”之象。人參、麥冬可益氣養(yǎng)血，養(yǎng)陰生津，針對本虛；水蛭、三七、丹參、川芎可活血通脈，冰片化火祛瘀，針對標(biāo)實(shí)，共奏補(bǔ)虛損、祛實(shí)邪之功。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，參蛭通心膠囊的7味藥材大都具有調(diào)節(jié)神經(jīng)中樞與免疫功能、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等靶器官、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜止痛、促進(jìn)代謝等功效[7-10]。人參皂苷Re、Rb1調(diào)節(jié)Cx43蛋白的表達(dá)，起到抗心律失常的作用[11]。丹參的主要成分丹參酮ⅡA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞離子通道，不僅可以抗心律失常，而且可減少心肌缺血再灌注性心律失常的發(fā)生，提高心率變異性[12-14]?，F(xiàn)代研究證實(shí)人參與丹參發(fā)揮抗心律失常作用均與抑制電壓依賴性Na+通道和主要K+通道的電流有關(guān)[15-16]。辛麗等[17]發(fā)現(xiàn)，“主心氣不足, 驚悸怔忡”的麥冬中的麥冬皂苷可迅速將失常的心律轉(zhuǎn)為正常竇性心律。麥冬和丹參作為抑制心律失常的藥物，在調(diào)研的149 項(xiàng)心律失常中藥療效驗(yàn)方專利中應(yīng)用比例過半[18]。

圖4 參蛭通心膠囊-室性早搏藥物-疾病核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 參蛭通心膠囊-室性早搏富集GO term BP，CC，MF三合一柱狀圖

圖6 參蛭通心膠囊-室性早搏KEGG通路富集分析氣泡圖

水蛭抗心律失常的機(jī)制可能與抑制凝血酶、改善血管內(nèi)皮功能等改善心肌灌注有關(guān)[19]。心肌灌注不充分有時(shí)會造成電解質(zhì)紊亂、心肌代謝或神經(jīng)系統(tǒng)失衡, 造成電穩(wěn)定性波動, 影響心肌的自律性和興奮性[20]。三七的主要成分三七總皂甙能明顯減少大鼠冠脈結(jié)扎早期各種室性心律失常的持續(xù)時(shí)間,抑制高鉀誘發(fā)的Ca2+濃度上升[21]。三七粉聯(lián)合長效倍他樂克治療室早，可明顯減少倍他樂克用量，還可降低不良事件發(fā)生率[22]。川芎在臨床中被證實(shí)能增效減毒，減少心律失常的復(fù)發(fā)，對中度及頑固性心律失常療效顯著。其主要機(jī)制可能與川芎嗪、阿魏酸減慢心率，改善冠脈供血與心肌代謝和明顯的中樞鎮(zhèn)靜作用有關(guān)[10]。吳偉曾用川芎治療1例心悸病的疑難雜癥[23]。冰片與大劑量麝香配伍能提高心搏驟停心肺復(fù)蘇后腦復(fù)蘇成功率，并可加速疾病恢復(fù)，改善預(yù)后[24]，降低心律失常所致猝死的風(fēng)險(xiǎn)。

圖8 參蛭通心膠囊-室性早搏cAMP signaling pathway路徑示意圖

圖9 參蛭通心膠囊-室性早搏MAPK signaling pathway路徑示意圖

由核心靶點(diǎn)圖、GO和KEGG分析可以得出，參蛭通心膠囊治療室性早搏主要是通過質(zhì)膜位置的蛋白質(zhì)結(jié)合和信號傳導(dǎo)等過程完成的，而主要的靶點(diǎn)有INS、ALB、IL6、AKT1、VEGFA、TNF、NOS3等，主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、cAMP signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、MAPK signaling pathway等。由主要信號通路的路徑示意圖可以得出，INS主要通過cGMP-PKG signaling pathway發(fā)揮作用，TNF主要通過MAPK signaling pathway發(fā)揮作用，NOS主要通過Calcium signaling pathway發(fā)揮作用。研究表明，INS是由胰島β細(xì)胞釋放的體內(nèi)唯一一種降糖類蛋白質(zhì)激素，其峰值增高與左室肥厚具相關(guān)性[25]。cGMP-PKG signaling pathway介導(dǎo)雙向調(diào)節(jié)血管平滑肌，對抗心臟肥大、動脈粥樣硬化和血管損傷或再狹窄后損傷等多個(gè)過程[26]。通過上調(diào)心肌細(xì)胞cGMP-PKG signaling pathway的利鈉肽受體A、鳥苷酸環(huán)化酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶，使cGMP表達(dá)增多；下調(diào)磷酸二酯酶5A，減少cGMP降解，兩方面促進(jìn)cGMP的持續(xù)作用，阻止心肌肥厚進(jìn)展，顯著提高射血分?jǐn)?shù)保留性心衰大鼠的心肌順應(yīng)程度[27]?？梢姡琁NS可能通過作用于cGMP-PKG通路，抗心肌肥厚，保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)，預(yù)防和治療室性早搏。室性早搏患者血清中的TNF-α、IL-6較健康人群的正常水平均有不同程度的波動[28]。馮丹等[29]研究結(jié)果表明，降低TNF-α、CRP，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，可有效減少室性早搏的發(fā)生，提示炎癥反應(yīng)可能是誘發(fā)室性早搏及疾病頑固性的原因之一[30]。IL-6作為心血管事件發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素和預(yù)測因子、數(shù)種免疫疾病的誘因，在多篇研究中作為獨(dú)立研究因素探討，與心臟病的發(fā)生密不可分，會引起心肌纖維化、心肌重構(gòu)等指標(biāo)的改變，進(jìn)而改變離子通道[31]。接受IL免疫治療時(shí)有14%～21%的概率會引起心律失常[32]。因此，抗炎治療在抑制心肌纖維化，調(diào)節(jié)自主神經(jīng)活動[33]，扭轉(zhuǎn)心律失常方面存在顯著效果。MAPK signaling pathway的抑制能為減輕炎癥反應(yīng)提供貢獻(xiàn)，還能減少細(xì)胞凋亡，減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷以及室性心律失常等[34]?？梢姡琓NF可能通過作用于MAPK通路，對抗炎癥反應(yīng)，達(dá)到抗心律失常的作用。NOS3屬于NOS家族，NOS在體內(nèi)催化產(chǎn)生NO，可調(diào)控從心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)到相關(guān)的信號調(diào)節(jié)等過程。NOS若失耦聯(lián)，Ca2+循環(huán)則會失調(diào),造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、心肌代謝障礙等改變，最終導(dǎo)致心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死。NOS3、RYR2可抑制細(xì)胞凋亡、改善內(nèi)皮功能、維持心肌Ca2+穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制房顫的發(fā)生發(fā)展[35]。Calcium signaling pathway分布且作用廣泛，Ca2+參與神經(jīng)信息的傳導(dǎo)與神經(jīng)細(xì)胞的老化、肌肉收縮和細(xì)胞形態(tài)的改變、腺體細(xì)胞的分泌等多個(gè)過程。心臟興奮-收縮耦聯(lián)同樣也離不開Ca2+，鈣穩(wěn)態(tài)對心肌結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)有不可或缺的影響，Ca2+的異常會造成心肌肥大或收縮障礙等[36]。由此得出，NOS3可能通過作用于Calcium signaling pathway，通過Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)節(jié)，影響各離子通道系統(tǒng)，調(diào)控心臟的自主神經(jīng)功能，避免心律失常的產(chǎn)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述核心靶點(diǎn)和信號通路通過參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、抑制炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、恢復(fù)心臟血流、清除自由基等一系列環(huán)節(jié)使室性早搏的癥狀得以緩解。分子對接結(jié)果表明藏紅花酸(Crocetin)、槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)等活性成分與靶蛋白INS、IL6、VEGFA、NOS3等具有很好的對接活性，提示參蛭通心膠囊活性成分與靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合，以此發(fā)揮治療室性早搏的效果。

表3 參蛭通心膠囊治療室性早搏的核心靶點(diǎn)及對應(yīng)主要成分的分子對接結(jié)果

圖10 參蛭通心膠囊-室性早搏配體與受體分子對接示意圖

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的途徑揭示了參蛭通心膠囊對室性早搏的治療作用，可能是通過以槲皮素等為代表的多成分，INS、IL6、NOS3等多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)控Calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、MAPK signaling pathway在內(nèi)的多個(gè)信號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)人體免疫、抑制炎性反應(yīng)及對抗氧化應(yīng)激等過程來實(shí)現(xiàn)的。但本研究仍存在一定的進(jìn)步空間，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫未考慮劑型等的影響作用，參蛭通心膠囊作為膠囊包裹的顆粒劑型對發(fā)揮藥效的影響未考慮入內(nèi)，同樣，室性早搏的發(fā)生機(jī)制也需要更加深入的探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。