謝偉，鄭巨佳，李芩耀，甘靜，林灼鋒

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027

糖尿病是由多因素引發(fā)的一種慢性代謝性疾病，調(diào)查顯示，中國糖尿病的估計(jì)患病率從2013年的10.9%增加到2018年的12.4%，而糖尿病前期的估計(jì)患病率從2013年的35.7%增加到2018年的38.1%[1]。糖尿病與腎衰竭、失明、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病密切相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，除高糖高脂飲食能誘導(dǎo)動物形成糖尿病外，長期高鹽飲食也會對血糖造成影響[3-4]。盡管食鹽作為一種必不可少的調(diào)味品有助于提高飲食的愉悅度和滿意度，但許多指南都推薦糖尿病患者進(jìn)行食鹽限制[5-6]，膳食鈉攝入量與普通人群的血壓升高呈正相關(guān)[7]，且高鈉飲食是中風(fēng)和心血管疾病的既定風(fēng)險(xiǎn)因素[8]。 然而，膳食鹽和葡萄糖穩(wěn)態(tài)之間的聯(lián)系仍不清楚，且沒有像高血壓那樣受到重視。大多數(shù)飲食干預(yù)并不關(guān)注鹽/鈉攝入量與糖尿病之間的關(guān)系?；谔悄虿〉奈：π?，我們亟需對高鹽誘導(dǎo)糖尿病的機(jī)制進(jìn)行研究。因此我們假設(shè)“鹽/腸道代謝物/高血糖”三者存在某種聯(lián)系，腸道代謝物可能在高鹽飲食小鼠高血糖進(jìn)程中具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：取8只8周齡的雄性C57BL/6J野生型小鼠，分成高鹽組（HSD組）和對照組（NSD組），每組4只。HSD組給予高鹽飼料（含8% NaCl），NSD組給予普通飼料（含0.5% NaCl），干預(yù)22周。小鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，室溫（22±1）℃，濕度（50±10）℃，自由攝食飲水。

1.1.2 主要儀器及試劑：全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-24/32，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16MS，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），高分辨質(zhì)譜儀（AB Triple TOF 5600，美國AB SCIEX公司），高效液相色譜儀（Waters ACQUITY UPLC，北京國譜科技有限公司），色譜柱[Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），北京國譜科技有限公司]。甲醇、甲酸（德國CNW Technologies公司），純水、乙腈（上海生工生物工程股份有限公司），LysoPC17:0（美國Avant公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)（glucose tolerance test,GTT）：小鼠禁食16 h后，在其尾巴末端1～2 mm處取血，測定空腹血糖（fasting plasma gulcose,FPG），記該時刻為0 min。讓小鼠適應(yīng)30 min之后，用0.9%的NaCl配置20%的葡糖糖溶液，按0.01 mL/g 的劑量進(jìn)行腹腔注射并開始計(jì)時。在10、20、30、45、60、75、90 min時檢測血糖值并記錄。

1.2.2 胰島素耐受實(shí)驗(yàn)（insulin tolerance test,ITT）：小鼠禁食16 h后，尾巴末端1～2 mm處剪一刀取血，滴血測定FPG，記該時刻為0 min。讓小鼠適應(yīng)30 min之后，按0.5 U/kg的胰島素劑量對小鼠進(jìn)行腹腔注射并開始計(jì)時。在15、30、45、60、90 min 時檢測血糖值并記錄。

1.2.3 小鼠尾動脈血壓測定：采用BP2000儀器通過尾套法測定小鼠尾動脈血壓，每天在同一時間點(diǎn)將小鼠放入儀器進(jìn)行測量，使其熟悉檢測環(huán)境，減少環(huán)境因素的影響。干預(yù)第22周時檢測小鼠尾動脈血壓并記錄。每只小鼠測量5組數(shù)據(jù)，取平均值。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動物處理：干預(yù)22周后稱量小鼠體質(zhì)量，用1%戊巴比妥（0.1 mL/10 g）進(jìn)行麻醉，處死小鼠。用75%乙醇消毒胸毛，輕輕剪開胸部表皮，在二、三肋間進(jìn)行心臟取血，并在4 ℃，3 000 r/min離心10 min，并將血清分裝于-80 ℃保存。取血后，剪開胸腔，用0.9%的NaCl對小鼠進(jìn)行左心室灌流后，取下并稱量小鼠的心、肝、腎、皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪和褐色脂肪組織，并在無菌條件下取出腸道糞便，所有組織分裝后于-80 ℃保存。

1.2.5 糞便樣本預(yù)處理：將-80 ℃凍存的糞便解凍， 各樣本稱取60 mg，置于1.5 mL EP管中，加入20 μL 甲醇配置的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL； Lyso PC17:0，0.01 mg/mL），加入600 μL的甲醇水溶液（體積比：CH3OH:H2O=4:1）。加入2個干凈小磁珠，-20 ℃預(yù)冷2 min，60 Hz研磨2 min，冰水浴中超聲提取10 min，-20 ℃靜置30 min，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min。取200 μL上清液，過濾后移至進(jìn)樣瓶。另從8個樣本的提取液中等體積提取液體混勻制備質(zhì)控樣本（QC），控制QC進(jìn)樣量與樣本進(jìn)樣量相同。

1.2.6 液相色譜-質(zhì)譜（liquid chranatography-mass spectrometry, LC-MS）分析：采用超高效液相串聯(lián)AB Sciex Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用色譜柱分析糞便標(biāo)本；柱溫為45 ℃；流動相組成：A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈/甲醇（2/3）（v/v）（含0.1%甲酸）；流速為 0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.7 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析：樣本經(jīng)LC-MS分析后，采用UNIFI 1.8.1軟件用于原始數(shù)據(jù)的采集，數(shù)據(jù)預(yù)處理在進(jìn)行模式識別之前，原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI v2.3軟件（英國Nonlinear Dynamics公司）進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化。使用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和自動建模分析，模式識別采用PCA分析?；衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，使用HMDB和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN等數(shù)據(jù)庫鑒定潛在標(biāo)志物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。GTT和ITT實(shí)驗(yàn)的曲線下面積（area under curve，AUC）根據(jù)公式計(jì)算：AUC=0.5×（血糖 0 min+血糖30 min）/2+0.5×（血糖30 min+血糖60 min）/2+1×（血糖60 min+血糖90 min）/2。在代謝組學(xué)分析中，同時采用多元變量統(tǒng)計(jì)模型的變量權(quán)重（variable important in projection, VIP）值和單變量統(tǒng)計(jì)t檢驗(yàn)的P值來篩選差異代謝物。采用多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中的VIP值來衡量各代謝物的表達(dá)情況對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度，篩出組間的差異代謝物，VIP＞1的代謝物被認(rèn)為是差異代謝物。在單變量統(tǒng)計(jì)分析中，用t檢驗(yàn)和變異倍數(shù)（fold change, FC）分析來篩選2組之間的差異代謝產(chǎn)物，以FC＞2.0且P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長期高鹽飲食對小鼠機(jī)體組分的影響 長期高鹽飲食可顯著抑制雄性C57BL/6J小鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05），同時顯著增加小鼠心臟、腎臟比重 （P＜0.05），但小鼠的皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪及棕色脂肪比重顯著降低（P＜0.01），而對小鼠肝臟比重?zé)o影響（P＞0.05），見表2。

表2 長期高鹽飲食對各組小鼠機(jī)體組分的影響（每組n=4）

2.2 長期高鹽飲食對小鼠血糖代謝及血壓的影響 與NSD組相比，HSD組收縮壓顯著升高（P＜0.01）；舒張壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HSD組FPG顯著升高（P＜0.05）；GTT曲線結(jié)果顯示，HSD組AUC值明顯高于NSD組，且HSD組血糖峰值顯著大于NSD組（P＜0.05）；ITT曲線結(jié)果顯示，2組的AUC值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 長期高鹽飲食可升高小鼠血糖及血壓

2.3 長期高鹽飲食對小鼠糞便代謝組學(xué)的影響

2.3.1 質(zhì)控結(jié)果：采用LC-MS檢測分析每個樣品，得到兩個原始質(zhì)譜文件（正離子模式和負(fù)離子模式）。QC樣本正負(fù)離子檢測模式下的每組樣品的質(zhì)譜總離子流圖出峰保留時間和峰面積重疊均較好，提示儀器穩(wěn)定。

2.3.2 模式識別結(jié)果：各組血清樣本分布PCA得分總體較清晰（見圖2），表明各組代謝表型差異較明顯。

圖2 NSD組、HSD組及QC樣本的PCA分析

2.3.3 長期高鹽飲食干預(yù)后差異代謝物：根據(jù)差異代謝物的精確相對分子質(zhì)量和二級質(zhì)譜圖鑒定差異代謝物，鑒定出12種差異代謝物包括：3-羥基辛烷基肉堿（3-hydroxyoctanoyl carnitine）、2-辛烯酸（2-otenedioic acid, 2-octenoate）、地紅霉素（drithromycin）、NBD-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油（NBD-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol）、20-乙基-前列腺素E2（20-ethyl-PGE2）、甜菊苷（stevioside）、雙哌啶（biperiden）、lysyl-蛋氨酸（lysyl-Methionine）、去甲膽酸（norcholic acid）、三萜醇黃皮萜醇（lansiol）、7，8，7’，8’-四脫氫黃質(zhì)（7，8，7’，8’-tetradehydroastaxanthin）、磷脂酰甘油磷酸甲酯（PGP-Me），見表3，各個差異代謝物在各組中的峰面積變化見圖3。HSD組小鼠糞便中的地紅霉素、NBD-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油、20-乙基-前列腺素E2、雙哌啶、去甲膽酸、三萜醇黃皮萜醇及磷脂酰甘油磷酸甲酯代謝物含量高于NSD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HSD組小鼠糞便中的3-羥基辛烷基肉堿、2-辛烯酸、甜菊苷、lysyl-蛋氨酸及7，8，7’，8’-四脫氫黃質(zhì)代謝物含量低于NSD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 2組小鼠12種差異代謝物的峰面積變化

表3 長期高鹽飲食干預(yù)后差異代謝物鑒定結(jié)果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，甜菊苷、黃連素、姜黃素和辣椒素等多種天然分子對胰腺β細(xì)胞具有再生和抗凋亡作用，還可通過刺激胰腺β細(xì)胞來增加胰島素分泌[9]。甜菊苷除了具有降低血糖、促進(jìn)胰島素分泌、改善胰島素抵抗等功效外，還具有降低血壓的作用[10]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)甜菊糖苷可通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporter 4, GLUT4）的合成，有效促進(jìn)糖尿病肌肉中的葡萄糖攝?。╣lucose uptake,GU）和氧化，其方式與二甲雙胍類似[10]。機(jī)制上講，甜菊糖苷與胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1, IRS-1）和GLUT4的結(jié)合親和力較高。甜菊糖苷通過激活I(lǐng)R/IRS-1/Akt/GLUT4通路，有效抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)糖尿病腓腸肌GU。甜菊醇和甜菊苷在糖尿病誘導(dǎo)的L6和3T3L1細(xì)胞中表現(xiàn)出胰島素模擬特性的分子證據(jù)[11]。甜菊糖苷被認(rèn)為是一種很有前途的治療2型糖尿病的植物藥物[10，12]。經(jīng)過PCA分析，結(jié)合圖譜表明，與對照組相比，高鹽飲食小鼠體內(nèi)甜菊苷代謝物的含量明顯降低。結(jié)合以上研究基礎(chǔ)，推斷高鹽的攝入可能影響著甜菊苷的吸收，進(jìn)而影響了血糖，導(dǎo)致GTT值升高。

氨基酸失衡與高血壓及其并發(fā)癥關(guān)系密切。除低鈉低膽固醇飲食外，適當(dāng)增加攝入同型半胱氨酸的前體物質(zhì)蛋氨酸，對減輕體質(zhì)量，降低血壓、血糖、血脂，抗脂質(zhì)過氧化，預(yù)防動脈硬化均有益處，而高水平的蛋氨酸攝入會產(chǎn)生不良反應(yīng)，如高同型半胱氨酸血癥、體質(zhì)量下降和膽固醇水平升高，因此，安全劑量的蛋氨酸具有一定的藥用價(jià)值[13]。在糖尿病中，高硫氨基酸（包括蛋氨酸和半胱氨酸）飲食與糖尿病死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)，而將攝入量降低至推薦膳食允許水平可導(dǎo)致終生風(fēng)險(xiǎn)的降低[14]。在1型糖尿病大鼠中，給予L-蛋氨酸喂養(yǎng)8周，可顯著改善血糖和胰島素水平，下調(diào)胰高血糖素和Bax表達(dá)。適當(dāng)補(bǔ)充蛋氨酸是一種減輕糖尿病誘導(dǎo)的β細(xì)胞死亡的新治療方法[15]。在其他疾病方面，有學(xué)者認(rèn)為限制蛋白質(zhì)和蛋氨酸攝入可改善健康和衰老代謝相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，并可能與成纖維細(xì)胞生長因子21、mTOR和自噬有關(guān)，改善線粒體功能和氧化應(yīng)激[16]。本研究中，小鼠GTT值較對照組顯著升高，蛋氨酸含量顯著下調(diào)，推測高鹽飲食可能改變了腸道微生態(tài)，從而干擾了小鼠對氨基酸物質(zhì)如蛋氨酸的吸收，高鹽飲食條件下，適當(dāng)增加蛋氨酸的攝入是否能夠改善小鼠血糖及糖耐量情況，值得進(jìn)一步探討。

胰島中前列腺素E（prostaglandin E, PGE）是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，主要由4種特異的膜G蛋白偶聯(lián)前列腺素E受體亞型（EP1、EP2、EP3和EP4）調(diào)控發(fā)揮生物作用[17]。PGE產(chǎn)量的增加和EP3的表達(dá)是導(dǎo)致2型糖尿病β細(xì)胞功能障礙的重要因素。然而，肥胖中存在許多相同的病理生理?xiàng)l件，而關(guān)于PGE的產(chǎn)生和信號傳導(dǎo)途徑如何影響非糖尿病β細(xì)胞的功能，目前知之甚少。研究表明，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）mRNA水平與人體體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）呈正相關(guān)，而EP3 mRNA水平也與BMI呈正相關(guān)。此外，IL-6的表達(dá)也與COX-2等PGE合成途徑基因的表達(dá)密切相關(guān)。使用EP3特異性拮抗劑的胰島素分泌測試證實(shí)了PGE產(chǎn)生的功能相關(guān)上調(diào)，胰島素含量隨供體BMI和胰島COX-2表達(dá)量的增加而增加，而EP3表達(dá)量則不受影響[18]。與非糖尿病對照組相比，從動物或人類器官供體分離的小鼠和人類胰島中，胰島EP3和PGE合成酶的表達(dá)和（或）PGE排泄本身都出現(xiàn)上調(diào)。2型糖尿病小鼠的全身代謝參數(shù)的改變與EP3介導(dǎo)的β細(xì)胞功能障礙的改善相關(guān)[19]。推測胰島PGE生成上調(diào)可能是胰島β細(xì)胞對肥胖和胰島素抵抗的適應(yīng)反應(yīng)的一部分，只有當(dāng)配體和受體在2型糖尿病中都高表達(dá)時才會功能失調(diào)。綜上研究，在給予小鼠長期高鹽飲食后，小鼠GTT值較對照組顯著升高，PGE2含量顯著上調(diào)，推測高鹽飲食顯著增加了雄性C57BL/6J小鼠的胰島PGE對鹽負(fù)荷的反應(yīng)。

有學(xué)者認(rèn)為2型糖尿病患者的血糖與血鈉存在密切關(guān)系，高鹽的攝入可能影響著葡萄糖的吸收，進(jìn)而影響血糖值[20]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高鹽溶液刺激胰島Min6細(xì)胞后能顯著抑制其胰島素分泌功能[21]。 體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予高鹽飲食3周后，即可發(fā)現(xiàn)血糖升高[22]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，長期高鹽飲食能增加糖尿病的患病率[23]，且高鹽攝入是一項(xiàng)糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[24]。機(jī)制上，高鹽飲食可能是通過腎臟皮質(zhì)近端小管上皮細(xì)胞的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)糖尿病[25]。血糖的升高也可能與高鹽飲食條件下的腸道中鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)升高有關(guān)[26]。既往研究表明，體內(nèi)棕色脂肪的含量增多或活性增加可以減輕胰島素抵抗及體內(nèi)炎癥情況[27]，而本研究中，鹽負(fù)荷小鼠皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪及棕色脂肪比重顯著降低，因此，小鼠血糖的升高跟鹽負(fù)荷后小鼠皮下棕色脂肪的減少可能存在某種關(guān)聯(lián)。通過LCMS代謝組學(xué)方法，我們初步觀察到長期高鹽飲食小鼠發(fā)生高血糖的原因可能與鹽負(fù)荷后出現(xiàn)的氨基酸代謝、胰島中前列腺素代謝及氧化應(yīng)激炎癥等調(diào)控失衡有關(guān)。此外，其他差異代謝物如3-羥基辛烷基肉堿、2-辛烯酸、7，8，7’，8’-四脫氫黃質(zhì)、NBD-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油等，目前尚未明確其對人體的作用機(jī)制，需后續(xù)的繼續(xù)關(guān)注與研究。

總之，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性C57BL/6J小鼠在鹽負(fù)荷后，體質(zhì)量減輕，心臟、腎臟比重顯著增加，但皮下脂肪、附睪脂肪、腎周脂肪及棕色脂肪比重顯著降低，血糖及血壓均顯著升高，糞便代謝組學(xué)結(jié)果顯示高鹽飲食小鼠存在氨基酸代謝、胰島中前列腺素代謝及氧化應(yīng)激炎癥等過程調(diào)控失衡，提示鹽負(fù)荷后高血糖形成機(jī)制錯綜復(fù)雜，有待于今后進(jìn)一步深入研究。