郭 美，王 兵，周恒花，王 萍△

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院：1.消化科；2.普外科；3.病理科，上海 200011)

miR-21廣泛表達(dá)于各種惡性腫瘤中，其表達(dá)增高可見于多種惡性腫瘤，包括肺、乳腺、胃、前列腺、結(jié)腸及頭面部腫瘤等[1-4]。程序性死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)為一種抑癌基因，在食管、胃、結(jié)腸和胰腺等消化道相關(guān)腫瘤中表達(dá)下降。miR-21通過下調(diào)PDCD4表達(dá)，干擾細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤生長，這一通路已被廣泛接受，但關(guān)于二者在結(jié)腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的關(guān)系卻鮮有報道。本研究分析結(jié)腸癌組織中的miR-21、PDCD4的表達(dá)情況及其相互關(guān)系，并對二者組織表達(dá)情況和患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2013年12月本院經(jīng)結(jié)腸鏡檢查病理確診為結(jié)腸癌的78例患者為研究對象，其中男58例，女20例，年齡27～85歲，平均(61.65±13.50)歲，所有患者行手術(shù)切除、同時留取距離癌灶5 cm以上的正常組織送檢。

1.2 方法

1.2.1檢測方法

將收集的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織放入10%多聚甲醛固定，脫水及包埋后行蘇木素-伊紅(HE)染色，后由兩位本院病理科醫(yī)師讀片。通過免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)腸癌組織及正常組織中PDCD4蛋白表達(dá)情況，采用S-P法:常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度無水乙醇水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；抗原修復(fù)，PBS洗滌3次；滴加3%過氧乙酸阻斷組織內(nèi)源性過氧化酶活性10 min(常溫條件下)，再使用PBS漂洗3次；滴加羊血清封閉液，室溫孵育30 min；棄去玻片血清，滴加1∶200的兔抗人PDCD4多克隆抗體(美國Abcam公司)，放置于4 ℃冰箱，孵育過夜；次日，PBS漂洗3次，滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBS漂洗3次；滴加即用型SP溶液，室溫孵育30 min，PBS漂洗3次；結(jié)束后，DAB顯色1～5 min，蘇木素復(fù)染120 s，自來水沖洗10～20 min，晾干，中性塑膠封片，出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性。每例標(biāo)本均用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-21及PDCD4 mRNA

結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織放置—80 ℃冰箱保存，按照RNA提取盒(加拿大Applied Biosystems公司)，使用qRT-PCR檢測mRNA表水平。取5 μL逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，按照反應(yīng)盒(加拿大Applied Biosystems公司)進(jìn)行擴(kuò)增。ACTB為內(nèi)參。PCR引物如下：miR-21上游引物，5′-TGA GAC TGA TGT TGA CTG TTG AA-3′，下游引物5′-TGT CAG ACA GCC CAT CGA C-3′；ACTB上游引物：5′-CCC AGC ACA ATG AAG ATC AA-3′，下游引物5′-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；PDCD4上游引物：5′-AAA GGG AAG GTT GCT GGA TAG-3′，下游引物為5′-CCA CCT CCT CCA CAT CAT ACA-3′。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。每個標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值為CT值，ΔCT值=目標(biāo)基因CT值—內(nèi)參基因CT值；以正常組織為對照組，ΔΔCT=ΔCT標(biāo)本—ΔCT對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征及HE結(jié)果

78例手術(shù)患者中腫瘤占據(jù)腸腔一周者5例，占據(jù)腸腔周徑>1/2的25例，≤1/2的48例；高分化腫瘤9例，中分化腫瘤52例，低分化腫瘤17例；浸潤深度：T1～T2共18例，T3～T4共60例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例。

2.2 PDCD4在結(jié)腸癌組織的表達(dá)情況

鏡下觀察結(jié)腸癌組織中PDCD4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中。78例結(jié)腸癌組織中70例(89.74%)PDCD4蛋白低表達(dá)或無表達(dá)，而癌旁組織表達(dá)呈強(qiáng)陽性。

2.3 結(jié)腸癌組織miR-21和PDCD4 mRNA表達(dá)情況

與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織PDCD4 mRNA表達(dá)水平較低，miR-21表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 結(jié)腸癌組織miR-21和PDCD4 mRNA表達(dá)情況

2.4 miR-21與PDCD4 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征關(guān)系

72例(92.31%)結(jié)腸癌組織中miR-21表達(dá)水平較癌旁組織高，68例(87.18%)PDCD4 mRNA表達(dá)水平較癌旁組織低。miR-21和PDCD4 mRNA表達(dá)情況在性別、年齡、分化程度、TNM分期中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但二者表達(dá)在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 miR-21與PDCD4 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征關(guān)系(n=78)

C:結(jié)腸癌組織；N：癌旁組織。

2.5 結(jié)腸癌組織miR-21和PDCD4 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

結(jié)腸癌組織miR-21與PDCD4 mRNA無表達(dá)相關(guān)性(r=0.006，P>0.05)。

3 討 論

miR-21與炎癥、腫瘤密切相關(guān)，且參與腫瘤細(xì)胞代謝過程，影響多個腫瘤抑制基因及信號通路，其中包括p53、PDCD4[5]、PTEN[6]、RECK[7]、TPM1、Maspin[8]及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因[9]等。有研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-21的HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞中，PDCD4、TGF-βR2和PTEN的表達(dá)水平均受到明顯抑制，而細(xì)胞克隆形成能力明顯強(qiáng)于正常對照組，在干細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)中存在類似的現(xiàn)象[10]。

PDCD4蛋白是蛋白激酶B(AKT)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路下游重要的靶點(diǎn)之一。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PDCD4蛋白可以通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、體外轉(zhuǎn)移和抑制凋亡能力發(fā)揮其抗腫瘤功能。ZHANG等[11]研究提示PDCD4蛋白下調(diào)侵襲相關(guān)蛋白AKT和MAP4K1的表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄活性，激活轉(zhuǎn)移抑制蛋白如E-cadherin和TIMP2的釋放。進(jìn)一步研究表明，高miR-21表達(dá)水平會引起PDCD4 mRNA低表達(dá)水平。PDCD4低表達(dá)者腫瘤體積較大，且較易發(fā)生遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移[12]，提示miR-21可能通過降低PDCD4的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。此外，有研究表明miR-21可通過miR-21-PDCD4-AP-1反饋環(huán)路增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中PDCD4 mRNA表達(dá)水平較低，且明顯低于癌旁組織，而miR-21則呈高表達(dá)。但本研究中未觀察到二者之間的相關(guān)性，可能需要納入更多的結(jié)腸癌病例進(jìn)行分析。此外，PDCD4是否影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，還有待深入研究。另外，本研究觀察到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移患者的miR-21和PDCD4 mRNA的表達(dá)均存在差異，二者是否與淋巴轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系或與本研究納入病例過少有關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量予以驗(yàn)證。

綜上所述，miR-21和PDCD4表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、TMN分期等臨床病理特征無關(guān)，說明在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程中，存在多條信號通路，而miR-21作用的PDCD4在其中未必占據(jù)主要地位，也有可能與本研究的樣本量不足有關(guān)，尚待今后進(jìn)一步觀察。本研究證實(shí)了miR-21和PDCD4在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及其相應(yīng)趨勢，說明二者和結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)。