解小慧 劉金星

1.山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，山東濟南 250000；2.山東省中醫(yī)院婦科，山東濟南 250000

早發(fā)性卵巢功能不全指40 歲之前的女性出現(xiàn)卵巢功能障礙，嚴重影響女性生育及心理健康[1]。2016 年歐洲人類生殖及胚胎學會指南[2]，早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）的診斷標準為：①月經(jīng)過少或停經(jīng)≥4 個月；②至少2 次血清促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）＞25 IU/L（間隔＞4 周）。

劉金星教授認為本病的基本病機為腎陰陽兩虛，應(yīng)滋腎益陰，溫腎助陽，故結(jié)合個人多年臨床經(jīng)驗，以二仙湯合二至丸加減制得補腎安坤湯（黃柏，仙茅，知母，熟地黃，巴戟天，淫羊藿，當歸，枳殼，香附，續(xù)斷，女貞子）。因復(fù)方中藥“多成分、多途徑、多靶點”協(xié)同作用的特點，使其現(xiàn)代化進程緩慢[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學有利于指導(dǎo)中藥新藥研發(fā)，傳承和發(fā)展中醫(yī)藥事業(yè)[4]。本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學，分析補腎安坤湯治療POI 的作用機制。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分的挖掘

根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），對中藥進行檢索。根據(jù)研究結(jié)果[5]，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為篩選條件。

1.2 檢索中藥相關(guān)靶點

依據(jù)Uniprot，找到靶點對應(yīng)蛋白。

1.3 中藥有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

依托Cytoscape 軟件，得到成分靶點網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)、整理并得到成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 檢索POI 靶點基因

依據(jù)Genecards 和OMIM，搜索premature ovarian insufficiency，得到疾病靶點基因，將藥物和疾病靶點基因取交集，得到補腎安坤湯治療POI 的關(guān)鍵作用靶點基因。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

藥物對疾病的治療效應(yīng)是多個PPI 的結(jié)果[6]。依托STRING 數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.6 GO 和KEGG 富集分析

為闡明中藥靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用，行GO 富集分析和KEGG 富集分析[7]。依托DAVID 數(shù)據(jù)庫，取FDR 值由小到大前20 做GO 分析。依托Cluego 軟件，得到KEGG 分析圖。

1.7 分子對接

選相互作用degree≥20 的靶標用DS ViewerPro對蛋白分子進行處理。利用AutoDock Tools 建立蛋白中心格點，將候選化合物與7 個候選靶點進行分子對接，選擇能量最低的結(jié)合模式利用PyMol 作圖。

2 結(jié)果

2.1 補腎安坤湯方劑組成藥物的有效活性成分、靶點、基因篩選

共檢索出150 個有效成分（淫羊藿23 個，黃柏37 個，仙茅7 個，巴戟天20 個，知母15 個，熟地黃2 個，枳殼5 個，香附18 個，續(xù)斷8 個，女貞子13 個，當歸2 個），將所獲有效成分以O(shè)B 值大小排序，列出前10 個有效成分。見表1。

表1 補腎安坤湯活性成分

2.2 中藥靶點預(yù)測及成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)共建

獲得1088 個成分作用靶點。得到中藥有效成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），Degree 較大的9 個節(jié)點可能是關(guān)鍵的化合物或靶點。

圖1 中藥有效成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 POI 靶點基因、補腎安坤湯治療POI 關(guān)鍵基因檢索

檢索到POI 靶點基因2718 個，166 個關(guān)鍵靶點。

2.4 補腎安坤湯治療POI 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

得到關(guān)鍵靶點基因網(wǎng)絡(luò)互作圖（圖2），該網(wǎng)絡(luò)包含153 個節(jié)點，1080 種相互作用關(guān)系，Degree≥20 的節(jié)點9 個，可能為補腎安坤湯治療POI 的關(guān)鍵蛋白。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 富集分析

GO 富集結(jié)果124 個，取FDR 值由小到大前20個GO 條目繪制條形圖，核心靶點的GO 功能富集在細胞表面等方面較為集中。見圖3。

圖3 GO 富集分析

2.6 KEGG 代謝通路富集分析

KEGG 分析共獲得228 條通路，顯著性靠前的通路主要有Pathways in cancer 等。見圖4。

圖4 KEGG 分析

2.7 分子對接

對9 個候選化合物與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中degree≥20 中的靶點進行分子對接，其結(jié)合能（表2），選取最優(yōu)結(jié)合模式作圖（圖5）。

圖5 分子對接模式

3 討論

通過分析，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素等為補腎安坤湯中的關(guān)鍵成分。槲皮素促進卵巢卵泡發(fā)育和成熟，通過在體內(nèi)和體外上調(diào)一些氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達來增加卵巢的抗氧化能力[8-11]。木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素[12-14]能夠有效促進卵巢顆粒細胞分泌雌二醇。以上提示，補腎安坤湯可能作用于槲皮素等靶點在抗氧化、刺激甾體激素分泌、提高卵巢功能等方面發(fā)揮作用。對于cAMP 信號通路的研究[15-18]，F(xiàn)SH 和LH 與其同源受體的結(jié)合導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的激活和cAMP 的產(chǎn)生，通過其激活的特異性信號通路可以生成雌酮和雌二醇，調(diào)節(jié)卵巢功能。通過張博等[19]、Detti等[20]的研究，甲狀腺激素通路對女性排卵等生殖功能有重要作用。腫瘤抑制因子p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)細胞周期停滯、衰老或凋亡，Makrigiannakis等[21]發(fā)現(xiàn)，p53 及其依賴通路在卵泡閉鎖中起重要作用，對人類卵泡發(fā)育和黃體功能具備重要的調(diào)節(jié)作用。何連利[22]、張晨曦[22-23]均研究顯示，p53信號通路在卵泡發(fā)育中必不可少。李德保等[24]研究證明激活或抑制Akt 可以影響眾多下游信號分子。陳薪等[25]實驗分析表示，當卵巢功能下降時，PI3K-AktmTOR 受到抑制，減少顆粒細胞增殖；當PI3K-Akt 被抑制時，降低了細胞的增殖，進一步惡化卵巢功能。以上顯示，補腎安坤湯可以通過cAMP 信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53 信號通路等對POI 產(chǎn)生多方面的治療作用。綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法發(fā)現(xiàn)補腎安坤湯中槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素等多種成分可作用于JUN、MAPK3、MAPK1 等多個靶點，通過cAMP 信號通路、甲狀腺激素信號途徑、p53 信號通路等多條信號通路治療POI，同時，分子對接發(fā)現(xiàn)補腎安坤湯中的多種成分與核心靶點有較好的結(jié)合，為其進一步藥理研究及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。