藍 英 趙世杰 唐 軍 胡 敏* 吳 洋

(1 廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，廣西南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧市 530021)

【提要】 鼻咽癌好發(fā)于中國南部地區(qū)人群，是該地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其病因學極其復雜。全基因組染色體雜合性缺失分析可定位鼻咽癌患者中染色體高頻缺失區(qū)域，鑒定出多個鼻咽癌相關的候選抑癌基因。研究表明11號染色體長臂(11q)缺失區(qū)域與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，并且定義了最小共同缺失區(qū)域，分別是11q14-23、11q23、11q23-24和11q24-11qter。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)11q缺失區(qū)域存在幾個與鼻咽癌發(fā)病密切相關的抑癌基因，如αB-晶狀體蛋白(CRYAB)、THY1、細胞黏附因子1(CADM1)、OPCML等基因。深入研究11q上抑癌基因將有助于更好地理解鼻咽癌的發(fā)病機理、診斷、治療和預后，從而做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，提高鼻咽癌患者的存活率和生存質量。

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，好發(fā)于生活在格陵蘭島和阿拉斯加州的原著民，以及北非一些地區(qū)和中國的南部，具有顯著的地理和種族分布特征[1]。鼻咽癌的病因學研究表明，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與環(huán)境中的化學致癌物、EB病毒感染和表觀遺傳學改變等因素密切相關。研究發(fā)現(xiàn)5%～10%的鼻咽癌患者具有家族聚集現(xiàn)象，表明鼻咽癌是一種涉及多個基因改變的遺傳性疾病，遺傳易感性在鼻咽癌的發(fā)病過程中可能起著重要作用[2]。本文就鼻咽癌患者中11號染色體長臂(long arm of chromosome 11, 11q)上缺失區(qū)域抑癌基因的失活與鼻咽癌的發(fā)生及惡性進展之間的關系作一綜述。

1 鼻咽癌的病變過程

鼻咽癌的致病過程極其復雜，它是多基因、多因素和多階段相互影響、相互作用的結果。EB病毒感染是鼻咽癌的重要病因，大約95%的鼻咽癌患者EB病毒呈陽性，且該病毒主要感染人類口咽部的上皮細胞和B淋巴細胞。鼻咽癌中已經(jīng)確定EB病毒感染是其致病因素，而且還發(fā)現(xiàn)EB病毒是第一個表達人類微小RNA的病毒，大多數(shù)情況下微小RNA負調控基因表達，參與基因沉默。目前，公認的鼻咽癌發(fā)生發(fā)展學說的轉化過程如下：鼻咽部上皮細胞由于慢性EB病毒感染或者外界物質(化學致癌物、有毒吸入劑或代謝性疾病)刺激觸發(fā)，隨后發(fā)生轉化。轉化后的細胞伴隨著一系列的增生和非典型增生，同時疾病惡性程度增高并伴有轉移的可能。異?；虻谋磉_引起正常細胞向癌細胞轉變并促進鼻咽癌發(fā)展，這些異?；蛟谡{控細胞周期、細胞黏附、細胞遷移和細胞凋亡方面起著重要的作用。隨之這些腫瘤細胞的分化程度降低，參與鼻咽癌的侵襲、轉移，表明腫瘤已經(jīng)進入晚期階段。

2 鼻咽癌中致病基因的頻繁改變

鼻咽癌在西方國家罕見，但在中國南部地區(qū)常見，其以EB病毒感染和密集的淋巴細胞浸潤為特征。EB病毒的潛伏感染在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的起始階段發(fā)揮重要作用，鼻咽上皮細胞EB病毒持續(xù)潛伏感染依賴于特定存在的遺傳改變。而單獨EB病毒感染不足以改變鼻咽上皮細胞，更多的遺傳和表觀遺傳的異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中必不可少。伴隨分子細胞遺傳學和雜合性缺失分析的不斷發(fā)展，研究者應用比較基因組雜交和微衛(wèi)星多態(tài)性位點全基因組掃描技術，證明原發(fā)鼻咽癌中基因組改變具有普遍性。這些基因組的改變主要包括1q，2q，3q，4q，5，6q，7q，8，9q，11q，12，15q，17q，18q，19和20的擴增以及1p，3p，9，11q，13q，14q，16和19p的缺失[3-7]。在這些異常染色體中，長臂上缺失最頻繁的是11q，表明11q缺失區(qū)域可能含有一個或者更多的抑癌基因。這些染色體區(qū)域抑癌基因的失活在鼻咽癌的發(fā)展中起著重要作用。近年來，一些研究者探討11q上缺失區(qū)域與鼻咽癌之間的關系，證明了11q缺失區(qū)域與鼻咽癌WHO分期密切相關，其在Ⅲ/Ⅳ期的鼻咽癌患者中更普遍[8]。鼻咽癌患者11q上的高頻缺失表明，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與11號染色體變異緊密相連。

3 人體腫瘤中染色體11q上最小共同缺失區(qū)域

基因組雜交技術證實了鼻咽癌中染色體11q上拷貝數(shù)的缺失改變非常普遍。微衛(wèi)星標記證明鼻咽癌患者染色體11q上最小共同缺失區(qū)域包括11q24-11qter(70.0%)，11q23(53.8%)，11q14-23(50.0%)，11q23-24(40.0%)，11q14(26.9%)，11q13(25.9%)[3-4，9]。在神經(jīng)母細胞瘤中，雜合性缺失研究證明染色體11q23區(qū)域普遍缺失，表明該區(qū)域存在抑癌基因，且該抑癌基因在大多數(shù)神經(jīng)母細胞瘤的惡變過程中普遍失活。20世紀90年代，一系列研究證明在乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和宮頸癌患者中11q23區(qū)域普遍缺失，且在卵巢癌、直腸癌、前列腺癌、膀胱癌和十二指腸腫瘤等患者的染色體11q上定義了最小丟失區(qū)域。這些研究結果表明，包括鼻咽癌在內的不同類型的惡性腫瘤患者染色體11q上的共同缺失區(qū)域可能含有一個或者多個抑癌基因參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

4 鼻咽癌患者染色體11q上抑癌基因的鑒定及其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用

4.1 鼻咽癌的候選抑癌基因 目前的研究認為，人類腫瘤多通過影響異常染色體區(qū)域腫瘤的相關基因來改變其拷貝數(shù)，進而促進腫瘤發(fā)生。分離并鑒定預測鼻咽癌相關抑癌基因能夠加深對鼻咽癌發(fā)病機理的了解。在過去的10年里，研究者已經(jīng)證實了染色體11q上存在4個鼻咽癌候選抑癌基因，包括αB-晶狀體蛋白(alpha B-crystallin,CRYAB)基因、THY1(CD90) 基因、細胞黏附因子1(cell adhesion molecule 1, CADM1)基因、OPCML(OBCAM)基因，這些基因通過啟動子甲基化或染色體缺失導致鼻咽癌中的抑癌基因失活(表1)。

4.2 CRYAB基因 CRYAB包含三個結構域：N-末端、R120和C-末端。CRYAB在晶狀體中被發(fā)現(xiàn)，分布于骨骼肌、肺、乳腺等組織中，屬于小熱休克蛋白家族成員之一。CRYAB能抑制細胞凋亡、參與細胞的修復，在生物體內發(fā)揮著重要的生物功能。此外，CRYAB與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。通過微陣列分析證明CRYAB基因位于染色體11q23.1區(qū)域，鼻咽癌中啟動子甲基化和11q22.3-23.1區(qū)域等位基因缺失能夠沉默CRYAB基因的表達。CRYAB是脊椎動物眼部主要的透明結構蛋白，可作為分子伴侶以避免變性蛋白質聚集。用11號染色體介導的卵巢瘤抑制實驗確定CRYAB基因為候選抑癌基因之一。為了獲得鼻咽癌患者染色體11q上另外三個關鍵區(qū)域的直接功能證據(jù)，研究者選擇供體細胞的11號染色體片段作為γ-射線微細胞介導染色體轉移的供體染色體，該供體染色體短臂部分已經(jīng)缺失。另外兩個供體細胞系是XMCH3.2和XMCH3.4，含有一個單拷貝11號染色體片段，該片段11q21-23區(qū)域及端粒進一步缺失[10]。XMCH3.2和XMCH3.4的區(qū)別在于染色體11q關鍵區(qū)域2和THY1位點的保留。與永生化鼻咽部上皮細胞系NP460相比，鼻咽癌細胞系微陣列基因表達譜明確了位于11號染色體關鍵區(qū)域3附近的CRYAB基因是表達下調最明顯的候選基因之一[11]。CRYAB基因的活化抑制了鼻咽癌腫瘤的形成、細胞黏附的缺失和侵襲、腫瘤微環(huán)境的相互作用、三維基質膠培養(yǎng)中侵襲突起的形成以及上皮間質轉變相關標志物的表達[12]。CRYAB在生理上與鈣黏蛋白/連環(huán)蛋白黏附連接相關聯(lián)。上述研究結果表明，CRYAB基因表達的蛋白產物通過與鈣黏蛋白/連環(huán)蛋白黏附連接，調節(jié)β-連環(huán)蛋白功能，進而抑制鼻咽癌的發(fā)展。

4.3 THY1基因 THY1也稱白細胞分化抗原CD90，是一種高度糖基化的細胞表面糖蛋白，位于染色體11q22-23區(qū)域附近，是免疫球蛋白家族中最小的成員[13]。THY1在成纖維細胞、內皮細胞、T細胞中表達，在細胞黏附、細胞遷移、干細胞分化中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)THY1基因與肝癌、鼻咽癌、軟骨肉瘤等腫瘤的發(fā)生密切相關。THY1基因位于胞外脂質體上，是一種細胞表面糖蛋白，大小25 kDa～37 kDa。THY1基因參與T細胞活化和其他非免疫功能，包括神經(jīng)軸突的生長抑制、凋亡信號、白細胞和黑色素瘤細胞黏附和遷移，以及成纖維細胞的生長和遷移[14]。最初發(fā)現(xiàn)THY1基因在致瘤和非致瘤雜交克隆中存在差異表達，這些雜交克隆的產物是將11號染色體轉入人類卵巢癌細胞系SKOV-3后得到。基因芯片分析證明鼻咽癌中THY1基因表達下調。鼻咽癌中THY1基因的失活機制歸因于高甲基化。體內致瘤實驗表明THY1基因抑制裸鼠體內HONE1細胞系腫瘤的形成，當THY1基因關閉的時候多西環(huán)素的存在恢復了其腫瘤形成能力[14]。在非致瘤性微細胞雜交中敲除THY1基因可抑制抑癌效應。進一步研究表明THY1基因的表達抑制了體外HONE1細胞的生長，使細胞生長停滯在G0/G1期，明顯地降低了細胞的貼壁生長能力。THY1基因的表達抑制了HONE1細胞的侵襲。淋巴結轉移癌中THY1基因表達下調的頻率顯著高于原發(fā)鼻咽癌。上述研究結果證實THY1基因的失活與鼻咽癌的發(fā)展和轉移密切相關，表明該基因是一個與鼻咽癌關系密切的候選抑癌基因。

4.4 CADM1基因 CADM1是免疫球蛋白超家族細胞黏附分子，位于染色體片段11q23.2。CADM1在上皮細胞附著部位廣泛表達，與肺癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)病密切相關。CADM1通過與人表皮生長因子受體和整合素α6β4在細胞表面形成復合物，從而干擾下游信號轉導和轉錄激活因子的活性，介導腫瘤細胞增殖和侵襲抑制作用。通過裸鼠致瘤實驗證明CADM1基因是一個非小細胞肺癌腫瘤的抑制基因[15]。CADM1基因的功能包括參與上皮細胞結構的形成和侵襲、免疫監(jiān)視和腫瘤抑制、突觸形成和精子的產生[16]。研究者發(fā)現(xiàn)34.2%的原發(fā)鼻咽癌中染色體11q22-23區(qū)域的CADM1基因呈異常甲基化。在非小細胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌和宮頸癌中，CADM1基因啟動子均呈現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象[17-18]。通過組織微陣列和免疫組織化學染色方法發(fā)現(xiàn)，鼻咽部淋巴結轉移癌中CADM1基因表達下調或者缺失的頻率顯著高于鼻咽部原發(fā)腫瘤，表明CADM1基因的表達與淋巴結轉移顯著相關。致瘤性實驗結果表明，CADM1基因的活化可以抑制裸鼠體內腫瘤形成。進一步研究證明，在正常培養(yǎng)條件下CADM1基因的表達抑制體外HONE1細胞系的生長，使HONE1細胞系的生長處于G0/G1期。通過微細胞介導的染色體轉移方法從供體細胞MCH556.15轉移一個完整的人類11號染色體到鼻咽癌HONE1細胞系，觀察到HONE1細胞系的致癌性功能受到抑制。鼻咽癌腫瘤抑制因子來源于HONE1/11號染色體的微細胞雜交體。與親本HONE1細胞系相比，雜交的HONE1細胞系腫瘤形成的潛伏期延長。精細定位抑瘤區(qū)域在染色體11q上1.8Mb區(qū)域(關鍵區(qū)域1)和11q22-23區(qū)域的其他三個關鍵區(qū)域，分別是0.36Mb區(qū)域(關鍵區(qū)域2)、0.44Mb區(qū)域(關鍵區(qū)域3)和0.3Mb區(qū)域(關鍵區(qū)域4)，且在關鍵區(qū)域4表現(xiàn)出高等位基因缺失，證明該區(qū)域存在一個抑癌基因。然而，在無血清培養(yǎng)條件下，CADM1基因誘導細胞凋亡。這些研究結果表明CADM1基因在鼻咽癌中扮演著一個抑癌基因的角色，且該基因與淋巴結轉移顯著相關。

4.5 OPCML基因 OPCML基因是在硅肺中鑒定出的基因之一，OPCML屬于免疫球蛋白超家族中糖基磷脂酰肌醇錨定細胞黏附分子中的IgLON家族。該基因在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，參與細胞黏附以及細胞與細胞之間的識別。OPCML基因是第一個與腫瘤發(fā)生相關的IgLON成員，該基因是脅迫應答基因，同時也是p53應答基因，啟動子甲基化常常削弱應答反應。OPCML基因是染色體11q上一個新的抑癌基因，我國學者于1989年首次從大鼠腦組織中分離純化。OPCML基因位于染色體11q25區(qū)域，它是一種阿片類受體型的細胞黏附因子，其主要功能是調節(jié)細胞間的黏附和識別，通過激活相關離子通道和腺苷酸環(huán)化酶而發(fā)揮抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，OPCML基因在肺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[19]。OPCML基因表觀遺傳沉默削弱了正常細胞應對環(huán)境壓力所表現(xiàn)出的細胞保護性反應，從而促進腫瘤的發(fā)展。研究者證實OPCML基因在上皮性卵巢癌、肺腺癌和膀胱癌中均呈現(xiàn)啟動子甲基化或基因缺失，在胃部和腦部腫瘤中表達明顯下調[20-22]。近年來的研究證明，鼻咽癌中位于染色體11q25區(qū)域的OPCML基因表達明顯下調，而且原發(fā)鼻咽癌中OPCML基因啟動子呈現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象，其甲基化率達到98%[23]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)OPCML基因的異位表達導致貼壁生長和懸浮生長的腫瘤細胞系均呈現(xiàn)出顯著生長抑制的現(xiàn)象。這些研究結果表明OPCML基因是一個廣泛的抑癌基因，參與鼻咽癌以及其他大多數(shù)腫瘤的發(fā)生。

5 結 語

綜上所述，研究者用不同的方法鑒定出染色體11q缺失區(qū)域存在4個與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展相關的抑癌基因。免疫組織化學染色結果表明，CADM1和THY1基因與鼻咽癌轉移密切相關。CADM1基因、THY1基因和CRYAB基因均有抗侵襲或抗上皮間質轉變的作用。這些抑癌基因的缺失或失活更多的是與疾病的晚期階段相關。研究者證實染色體11q上存在越來越多的頻繁缺失區(qū)域，促使我們從這些缺失區(qū)域找到更多與鼻咽癌發(fā)病密切相關的抑癌基因。我們可以應用基因補充和基因置換以及導入多種抑癌基因的治療方法去抑制癌癥，從而防止其惡性進展。同時，理解這些抑癌基因的活化作用以及鼻咽癌發(fā)展中EB病毒、微小RNA和抑癌基因之間的關系極其重要，可以加快微環(huán)境、免疫監(jiān)視和消除、癌細胞轉變和浸潤的研究。此外，還需要通過宿主和EB病毒基因表達進一步研究剖析各種下游因子和信號通路改變的復雜作用，從而降低鼻咽癌的發(fā)病率，提高鼻咽癌患者的存活率，改善預后。