趙婷婷，陳彥伶，胡成剛，唐 娟，陳桃香，胡家震

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽550025)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎及對(duì)稱性、破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鞯穆?、全身性自身免疫疾病，發(fā)病率及致殘率較高[1-2]。近年來雖在RA發(fā)病機(jī)制及病理變化等研究領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，但是在治療方面，盡管西藥應(yīng)用廣泛、療效好，但依舊有一定的毒副作用，部分患者使用藥物后可能存在心血管不良反應(yīng)和感染等風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找安全有效的治療藥物，明確其作用機(jī)制，對(duì)RA的臨床治療有著重要的意義。

苦皮藤CelastrusangulatusMaxim.是一種多年生藤狀灌木，為衛(wèi)矛科Celastraceae南蛇藤屬CelastrusL.植物，別名有吊干麻、老虎麻、苦樹皮等[3-4]。據(jù)《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)及《中藥大辭典·上冊(cè)》(2006年版)中記載，苦皮藤(吊干麻)具有祛風(fēng)除濕、活血通經(jīng)、解毒殺蟲的功效，可用于治療風(fēng)濕痹痛、骨折傷痛、閉經(jīng)、瘡瘍潰爛、頭癬、陰癢等疾病[5-6]。在民間，苦皮藤單用或配方，可用于改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀體征，具有一定的研究?jī)r(jià)值。據(jù)《貴州草藥》記載，苦皮藤、藤蘿根、白金條各30 g，泡酒服用可以治療風(fēng)濕、勞傷、關(guān)節(jié)疼痛[7]，為苦皮藤的應(yīng)用提供了文獻(xiàn)參考?？嗥ぬ僭诿缱迕耖g常用于治療風(fēng)濕類疾病，療效較好，但是關(guān)于苦皮藤抗RA作用方面的研究在國(guó)內(nèi)外尚無具體報(bào)道。本課題組前期通過體外培養(yǎng)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞(HFLS-RA)，明確苦皮藤石油醚及二氯甲烷部位均有治療抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用[8]。因此，本研究進(jìn)一步觀察苦皮藤對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠足趾部炎癥反應(yīng)病理學(xué)變化的改善作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠(SPF級(jí))，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度為21～25 ℃，濕度為40%～60%，12 h/12 h明暗周期(8：00-20：00)條件下飼養(yǎng)，食用正規(guī)鼠用飼料及滅菌自來水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

苦皮藤(CelastrusangulatusMaxim.)于2019年5月采自貴州省安順市鎮(zhèn)寧布依族苗族自治縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館胡成剛教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物苦皮藤的根，憑證標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館。苦皮藤提取物的制備：稱取1 kg苦皮藤根粗粉，依次加入8倍、6倍、6倍75%乙醇75 ℃下回流提取2 h，過濾，除去藥渣，合并濾液，減壓濃縮至浸膏。得到150.60 g醇提物干浸膏，得膏率為15.06%。取適量干浸膏加純水溶解制成混懸液，根據(jù)極性大小采用石油醚、二氯甲烷等比例反復(fù)萃取飽和水溶液三次，萃取至有機(jī)層無色，減壓回收溶劑，剩余層揮干水分保存。最后得到苦皮藤石油醚(Petroleum ether，PE)部位、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)部位萃取物，稱重，備用。雷公藤多苷片(貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1450003)。灌胃前用0.5% CMC-Na溶液配成一定濃度的溶液。

1.3 試劑及儀器

弗氏完全佐劑(Sigma，批號(hào)：J180035)、羧甲基纖維素鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170724)、多聚甲醛溶液(4% PFA)(Leagene，批號(hào)：0728A20)、二甲苯(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200601)、EDTA脫鈣液(Solarbio，批號(hào)：20200728)、蘇木素染液(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：ZH193907)、伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C200403)、中性樹膠(Biosharp生物公司，批號(hào)：69120060 BL704A)、自動(dòng)組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，批號(hào)：JT-12S)、全自動(dòng)染色機(jī)(常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：RS36型)、包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠，批號(hào)：BMJ-A型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立[9-10]

造模前用酒精對(duì)大鼠左側(cè)后足墊消毒，皮內(nèi)注射0.1 mL弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，CFA)，針頭往前注射一半后，調(diào)轉(zhuǎn)針頭注射全部CFA，拔出針頭后按壓一定時(shí)間，防止溢出。正常組大鼠用生理鹽水同法處理。

2.2 分組及給藥

采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，將大鼠體質(zhì)量分為180～190 g、190～200 g、200～210 g、210～220 g四個(gè)區(qū)組，組內(nèi)編號(hào)，利用Excel獲取隨機(jī)數(shù)字后進(jìn)行排序分組。具體分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(雷公藤多苷片)、石油醚部位低中高劑量組、二氯甲烷部位低中高劑量組，每組8只，共72只。

當(dāng)造模后第7天，開始定時(shí)灌胃治療，每日2次，給藥體積為1 mL·100 g-1，連續(xù)給藥21 d。雷公藤多苷片給藥劑量為7.88 mg·kg-1；石油醚部位低、中、高給藥劑量分別為2.75 g·kg-1、5.50 g·kg-1、10.99 g·kg-1；二氯甲烷部位低、中、高給藥劑量分別為22.580 g·kg-1、45.15 g·kg-1、90.30 g·kg-1；正常對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水。

2.3 各組大鼠的狀態(tài)觀察及體重、足腫脹體積、臟器指數(shù)測(cè)定

造模后，每4天測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量、足腫脹體積。末次給藥后，分離其脾臟和胸腺組織，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

造模后，每7d對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。按大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎全身病變5級(jí)評(píng)分法(0～4級(jí))，對(duì)大鼠4只肢體的病變程度累計(jì)積分[9]。五級(jí)評(píng)分法：0分：腳爪正常，無紅腫；1分：足小趾關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)、足趾中度紅腫；3分：踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫或踝關(guān)節(jié)以下全部紅腫；4分：整個(gè)腳爪嚴(yán)重紅腫，甚至關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形。

2.5 足踝關(guān)節(jié)病理切片

末次給藥后，處死大鼠，取大鼠踝、膝關(guān)節(jié)在內(nèi)的整個(gè)左后肢，放置于4%多聚甲醛溶液中浸漬固定48 h。然后將組織放入EDTA脫鈣液中脫鈣，每隔3天觀察脫鈣效果，并更換新鮮脫鈣液，直至脫鈣完成。脫鈣組織固定組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，切片脫蠟至水，蘇木精染色10～20 min，自來水沖洗1～3 min，鹽酸酒精分化5～10 s，自來水沖洗1～3 min，放入50 ℃的溫水中或弱堿性水溶液返藍(lán)，直到出現(xiàn)藍(lán)色為止，自來水沖洗1～3 min，放入85%酒精3～5 min，伊紅染色3～5 min，水洗3～5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以上標(biāo)本均按病理檢驗(yàn)SOP程序進(jìn)行。切片進(jìn)行鏡檢，采集切片圖像，每張切片先于40倍下觀察全部組織。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 一般情況

正常組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，皮毛有光澤。模型組大鼠精神狀態(tài)較差，飲食情況及活動(dòng)能力有所降低，甚至出現(xiàn)爬行困難，部分大鼠出現(xiàn)便溏。治療3周后，陽性對(duì)照組、PE部位給藥組與DCM部位給藥組大鼠的上述癥狀均有所緩解。

3.2 苦皮藤提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型體質(zhì)量的影響

治療3周后，陽性對(duì)照組、PE部位給藥組與DCM部位給藥組大鼠的體質(zhì)量均持續(xù)增加，結(jié)果見表1。

3.3 苦皮藤對(duì)大鼠足跖腫脹度的影響

給藥前，與正常對(duì)照組比較，各組造模大鼠左側(cè)足跖腫脹度明顯(P<0.01)，且各造模組組間大鼠的足跖腫脹度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功。在第14天左右，出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎。與正常組相比，模型組大鼠的左后足跖腫脹度顯著增大(P<0.01)。與模型組相比較，陽性對(duì)照組、DCM中、高劑量組大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹度有顯著性降低(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見表2。

表1 苦皮藤提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型體質(zhì)量的影響

表2 苦皮藤提取物對(duì)AA大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

3.4 免疫器官指數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，模型組大鼠的胸腺指數(shù)較正常組顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，陽性對(duì)照組及DCM高劑量組能顯著降低胸腺指數(shù)(P<0.05)；PE低、中、高劑量組與DCM低、中劑量組能不同程度降低胸腺指數(shù)，但差異不顯著(P>0.05)。

與正常組相比，模型組大鼠的脾指數(shù)升高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組相比，給藥組脾指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 苦皮藤提取物對(duì)AA大鼠免疫器官指數(shù)的影響

3.5 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分結(jié)果

與正常對(duì)照組相比較，各組大鼠注射CFA后，致炎局部即出現(xiàn)腫脹，2 h左右出現(xiàn)紅腫充血的現(xiàn)象，24 h腫脹程度達(dá)到高峰，隨后腫脹逐漸減輕，部分大鼠足墊注射部位出現(xiàn)潰爛，5～6天逐漸結(jié)痂。第14天左右模型組大鼠四只肢體出現(xiàn)不同程度腫脹，部分大鼠有活動(dòng)障礙，經(jīng)統(tǒng)計(jì)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，陽性對(duì)照組與PE高劑量組與DCM高、中、低劑量組的大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分有顯著性降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表4。

3.6 苦皮藤提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)組織病理組織學(xué)的影響

各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)見圖1，正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，表面被覆薄層透明軟骨，關(guān)節(jié)面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻，軟骨內(nèi)無血管和神經(jīng)；滑膜結(jié)構(gòu)清晰完整，滑膜組織無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。

AA模型組關(guān)節(jié)軟骨表面輕微侵蝕，見軟骨層厚薄不一，表面有纖維組織增生；滑膜結(jié)構(gòu)較清晰，少量脫落于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，滑膜襯里層不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞為主，滑膜細(xì)胞增生，見核呈長(zhǎng)橢圓形的成纖維樣滑膜細(xì)胞增多，滑膜局部見多量毛細(xì)血管增生形成血管翳。

陽性對(duì)照組有滑膜結(jié)構(gòu)較清晰，少量脫落于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，有少量滑膜細(xì)胞增生，滑膜組織有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

表4 苦皮藤提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)評(píng)分的影響 分)

PE低、中、高劑量組滑膜襯里層少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，滑膜細(xì)胞增生減少，少量滑膜細(xì)胞壞死，見胞核固縮、碎裂，胞質(zhì)溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，血管翳減少，無明顯軟骨及骨組織破壞。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇AA模型為動(dòng)物模型，AA模型發(fā)病機(jī)制為結(jié)核桿菌通過分子模擬和交叉反應(yīng)，激活處于靜止?fàn)顟B(tài)的針對(duì)Ⅱ型膠原為主的淋巴細(xì)胞克隆，從而引起自身免疫反應(yīng)[11]。AA大鼠表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)局部紅腫，嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形，病理變化為滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成血管翳[12]。AA模型在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)改變和病理機(jī)制等方面與人RA有許多相似特征，是篩選和研究治療RA藥物的較理想模型。據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，用于RA模型的大鼠有SD大鼠、Wistar大鼠及Lewis大鼠，SD大鼠綜合發(fā)病率與發(fā)病程度高于Wistar大鼠、Lewis大鼠兩個(gè)品系。本實(shí)驗(yàn)選用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)SD大鼠，成功建立了AA模型。

在AA動(dòng)物模型中，評(píng)價(jià)RA藥物療效的重要指標(biāo)是足腫脹體積和關(guān)節(jié)病理變化[14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，苦皮藤的提取物可不同程度降低AA大鼠足腫脹度，降低關(guān)節(jié)評(píng)分。同時(shí)減輕踝關(guān)節(jié)組織病理改變，使炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，血管翳形成減少。其中以二氯甲烷中、高劑量組效果較突出。石油醚低、中劑量組對(duì)AA大鼠癥狀改善效果不明顯，高劑量組有一定效果。表明，苦皮藤對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有潛在防治作用。

注：滑膜細(xì)胞增生()滑膜細(xì)胞壞死(▲)淋巴細(xì)胞()漿細(xì)胞() A：空白組；B：模型組；C：陽性對(duì)照組；D：PE低劑量組；E：PE中劑量組；F：PE高劑量組；G：DCM低劑量組；H：DCM中劑量組；I：DCM高劑量組。

RA是一種自身免疫性疾病，可造成免疫器官如胸腺和脾臟發(fā)生腫大，甚至病理性損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的胸腺指數(shù)較正常組顯著增加。與模型對(duì)照組比較，DCM高劑量組能顯著降低胸腺指數(shù)，PE低、中、高劑量組與DCM低、中劑量組能不同程度降低胸腺指數(shù)。表明，苦皮藤提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用與恢復(fù)免疫器官功能有關(guān)。綜上所述，苦皮藤具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，可作為良好的抗RA藥物繼續(xù)研究。

本實(shí)驗(yàn)大鼠給藥劑量的確定來自本課題組前期的工作，本課題組選用KM小鼠進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，按照含有苦皮藤原生藥材含量計(jì)算，石油醚部位的半數(shù)致死量為157.04 g·kg-1·d-1，其95%的可信區(qū)間為133.66～184.50 g·kg-1·d-1，二氯甲烷部位的最大耐受量為258 g·kg-1·d-1。根據(jù)大鼠的給藥劑量是小鼠給藥劑量的0.7倍，折算得到大鼠的給藥劑量。再設(shè)置高中低劑量時(shí)，石油醚部位取1/10、1/20、1/40，二氯甲烷部位取1/2、1/4、1/8。