鮑秋羽，席建元

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410208)

銀屑病(Psoriasis，PS)是一種由免疫所介導(dǎo)的以紅色斑塊并覆有鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性、炎癥性皮膚病[1]。中醫(yī)學(xué)屬“白疕”范疇。流行病學(xué)調(diào)查顯示，1990-2017年間，我國銀屑病患病率呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，至2017年，銀屑病患者人數(shù)已達800多萬，較1990年增長了1.95倍[2]。該病除致皮膚癥狀外，還可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛不利，伴有糖尿病、肥胖以及心腦血管等疾病，嚴(yán)重影響著患者的身心健康[3，4]。因此，銀屑病一直是皮膚病研究領(lǐng)域的熱點之一[5]。銀屑病的病理表現(xiàn)為表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增生及分化，伴隨有皮膚血管異常增生以及炎癥細(xì)胞的浸潤[6，7]。該病的發(fā)病機制與遺傳、免疫、環(huán)境、感染等因素相關(guān)，但尚未完全明確[8]。有研究表明，銀屑病的發(fā)生發(fā)展與T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等及其所分泌的細(xì)胞因子之間有復(fù)雜的聯(lián)系。IL-23在機體免疫中主要發(fā)揮著致炎效應(yīng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α，并放大炎癥反應(yīng)[9]。IL-17可促進Treg細(xì)胞分裂增生，可有效抑制Th17細(xì)胞的增生分化，達到抑制炎癥反應(yīng)的目的[10]。因此，對IL-17和IL-23在銀屑病發(fā)病進程中產(chǎn)生的機制深入研究，或成為銀屑病治療的突破點。前期研究發(fā)現(xiàn)，銀屑平丸治療PS療效顯著，且不良反應(yīng)少[11]。本實驗擬采用咪喹莫特乳膏制造BALB/c小鼠PS模型，進一步探討銀屑平丸治療PS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF清潔級雌性BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量18～20 g，8～12周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號：SCXK(湘)2019-0004)。將小鼠置于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物實驗中心(溫度控制在(21±3) ℃、相對濕度保持在40%～70%飼養(yǎng)，小鼠飼料及可用飲水均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。所有小鼠在實驗前予以5天的適應(yīng)性喂養(yǎng)，且實驗全程按照動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進行。

1.2 實驗藥物

銀屑平丸為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由我院制劑室提供(批號：20201204，規(guī)格：60 g/瓶)；阿維A膠囊(重慶華邦制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號：H20010126，規(guī)格：10 mg)；5%咪喹莫特乳膏(四川明欣有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號：國藥準(zhǔn)字H20030129，規(guī)格：3 g：0.15 g，3 g/支)；白凡士林(南昌白云藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，贛食藥準(zhǔn)字：F20050006，規(guī)格：500 g)。

1.3 主要試劑與儀器

PBS(美國Hyclone，貨號：80334412)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)IL-17、IL-23試劑盒(武漢博士德生物，貨號分別為：EK0866、EK1364)；酶標(biāo)儀：深圳匯松(型號：MB-530)。

1.4 動物分組

通過隨機數(shù)字表分組法將40只小鼠分為5組，包括空白對照組、模型組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、阿維A膠囊+銀屑平丸組(中西結(jié)合組)，每組8只小鼠。

1.5 PS小鼠模型的建立

實驗前將40只小鼠通過戊巴比妥鈉腹腔注射進行藥物麻醉(80 mg/kg)，隨后使用動物專用剃毛儀給麻醉后實驗小鼠清除背部白毛，充分暴露背部皮膚以外涂藥物造模，面積約3 cm×4 cm大小，其中空白對照組小鼠使用凡士林造模，其他各組小鼠使用5%咪喹莫特乳膏造模，1次/天，連續(xù)外用8天。

1.6 動物給藥

依據(jù)銀屑平丸臨床藥量標(biāo)準(zhǔn)，每人每日服用藥量為0.75 g/kg，根據(jù)人與實驗小鼠體質(zhì)量比例計算，本研究中用量與臨床等效劑量相當(dāng)，設(shè)定為6.49 g/kg/d。同公式換算可得出阿維A膠囊組的臨床等效量為6 mg/kg/d。使用生理鹽水加熱充分溶解銀屑平丸粉劑及阿維A膠囊粉劑制備實驗所用藥液。外用藥物造模同時，空白對照組以及模型組小鼠灌胃生理鹽水0.4 mL；阿維A膠囊組小鼠灌胃阿維A藥液0.4 mL；銀屑平丸組小鼠灌胃銀屑平丸藥液0.4 mL；每組小鼠每天灌胃1次，連續(xù)用藥8天。

1.7 動物取材

實驗第8天24 h后，每只小鼠在眼球處取血1.0 mL，隨即將血液置于4 ℃的低溫下離心1 500轉(zhuǎn)/min共5 min，并立即抽吸上層血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于檢測本次實驗的炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-23。后續(xù)斷頸處死每只小鼠，使用無菌儀器在小鼠造模處留取皮膚組織，面積約1 cm×1 cm左右，分組固定保存于已序號標(biāo)記的福爾馬林溶液中，脫水后石蠟包埋，然后切片，進行HE染色。

1.8 指標(biāo)觀察

觀察每組小鼠皮損變化并予以皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)(Psoriasis area and severity index，PASI)評分，酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組小鼠血清IL-17、IL-23的表達水平，HE染色觀察各組小鼠的皮膚病理改變。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠形態(tài)學(xué)觀察及PASI評分情況

密切觀察各組小鼠造模后的皮損情況，在第8天后可見模型組小鼠皮損處出現(xiàn)紅斑、大量鱗屑，且皮疹較為肥厚，表現(xiàn)為銀屑樣改變；阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結(jié)合組小鼠皮損均有不同程度的緩解，其中中西結(jié)合組小鼠皮損改善最明顯，具體見圖1。與空白對照組相比，模型組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結(jié)合組小鼠背部皮損的PASI評分均顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結(jié)合組小鼠背部皮損的PASI評分均顯著降低(P<0.05)，其中中西結(jié)合組療效最佳(P<0.05)，具體見表1。

注：A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；D：銀屑平丸組；E：中西結(jié)合組。

表1 各組小鼠PASI評分情況 分)

2.2 各組小鼠皮損組織病理學(xué)改變

各組小鼠皮損組織HE染色結(jié)果顯示，空白對照組皮膚組織結(jié)構(gòu)較完整，可見清晰的角質(zhì)層、顆粒層及基底層；模型組皮損組織可見明顯的角質(zhì)層斷裂，大量的皮膚乳頭水腫。阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結(jié)合組視野下可見角質(zhì)層斷裂存在不同程度的改善，其中中西結(jié)合組改善程度較為明顯。具體見圖2。

2.3 各組小鼠血清炎性因子表達水平

ELISA結(jié)果顯示，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、中西結(jié)合組小鼠血清IL-17、IL-23表達水平均顯著降低，其中中西結(jié)合組效果最佳(P<0.05)。具體見表2。

表2 各組小鼠血清IL-17、IL-23表達水平

注：A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；D：銀屑平丸組；E：中西結(jié)合組。

3 討論

研究表明，銀屑病的發(fā)病機制主要與機體免疫相關(guān)，T淋巴細(xì)胞貫穿銀屑病病程的始終，T淋巴細(xì)胞可通過分泌不同的細(xì)胞因子，包括IL-17、IL-23、TNF-α等[12]。這些炎癥因子促使角質(zhì)形成細(xì)胞不斷增殖分化產(chǎn)生鱗屑性斑塊，刺激血管不斷增殖、擴張，并使炎癥細(xì)胞浸潤而形成紅斑[13]。研究顯示，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞之間關(guān)系失衡可能是銀屑病發(fā)病的新線索，在銀屑病患者的皮損中，Th細(xì)胞及其細(xì)胞因子較正常人群增加，而Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子則相對有所減少，其中Treg細(xì)胞在皮膚中能免疫耐受共生微生物，抑制炎癥的發(fā)展[14]。IL-17、IL-23均為T淋巴細(xì)胞所分泌，若闡明IL-17、IL-23炎癥因子在銀屑病發(fā)病過程中的作用，可能為銀屑病治療的新方向。

中醫(yī)學(xué)對銀屑病病因的認(rèn)識最早可追溯至隋代，隋代醫(yī)家巢元方在《諸病源候論》中認(rèn)為“干癬”以外感風(fēng)邪為主因，夾雜寒濕之氣合而入里，侵襲人體肌腠，凝滯氣血，氣血失暢而為病，開創(chuàng)了銀屑病外邪致病的先河。唐宋醫(yī)家繼承并發(fā)展銀屑病外邪致病理論，唐代王燾在《外臺秘要》、宋代趙佶在《圣濟總錄》中均有提及[15]。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院席建元教授根據(jù)該病的病因病機，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)立“涼血養(yǎng)陰，清熱解毒”的治療原則，并研發(fā)出銀屑平丸，長期臨床運用，廣受患者好評[16-17]。該藥物由生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、赤芍、防風(fēng)、女貞子、旱蓮草、甘草組成。方中君藥生地黃甘而苦寒，以寒之性涼解血熱，養(yǎng)陰之效顧護津液，使邪氣祛除不損正氣；赤芍、丹皮、丹參味苦性微寒，均以血治，達肝經(jīng)清郁滯之火毒，入血分清蘊結(jié)之瘀熱，涼解血熱又能消散瘀血，防止熱與血結(jié)；紫草甘寒同入血分，清解血分熱毒，透泄斑疹；白花蛇舌草酸涼，半枝蓮、大青葉苦寒，三藥相合，清泄血熱，涼解火毒，專攻火熱毒盛，共為臣藥。血熱內(nèi)蘊，煎熬津液，津傷不能濡潤肌膚，女貞子、墨旱蓮互為佐藥入肝腎以滋養(yǎng)肝腎之陰，益下榮上，養(yǎng)陰潤燥以生津化液榮養(yǎng)肌膚。防風(fēng)辛散驅(qū)邪外出，且為治風(fēng)潤藥，功善疏風(fēng)止癢；甘草善清熱解毒調(diào)和諸藥，與防風(fēng)共為使藥，諸藥相合，共奏涼血養(yǎng)陰、清熱解毒之功。

本研究顯示，銀屑平丸聯(lián)合阿維A膠囊可明顯改善PS小鼠模型的皮損情況，均較單獨使用銀屑平丸或阿維A膠囊療效更佳，作用機制可能與抑制PS小鼠模型血清IL-17、IL-23炎性因子表達水平相關(guān)，但其深入機制仍需進一步的實驗研究予以闡明。