張曉文，王 祎，張 嬋，張 迪，贠 航，黃 笛

1.商洛學(xué)院健康管理學(xué)院護(hù)理系，商洛 726000；2.陜西“四主體一聯(lián)合”秦嶺健康食品配料及核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)校企聯(lián)合研究中心，商洛 726000

近年來，慢性疾病已成為人類健康的重大威脅。其中，非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起的心血管疾病在慢性疾病中所占比例相當(dāng)大［1］。NAFLD是最為常見的肝臟疾病，在一般人群中發(fā)病率為20%～30%，而在肥胖人群或糖尿病患者中發(fā)病率高達(dá)70%～90%［2］。某些NAFLD患者可能會(huì)進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌［3］。而且，有研究［4］提出脂肪肝與AS及冠心病關(guān)系密切。NAFLD患者具有較高的心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)和病死率，且NAFLD患者發(fā)生心血管疾病而導(dǎo)致死亡的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肝臟其他并發(fā)癥［5］。因此，對(duì)于NAFLD的預(yù)防與控制顯得尤為重要。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9 （proprotein convertase subtilisin kexin 9，Pcsk9）基因，編碼一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，名為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1（neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1）［6］。該蛋白可介導(dǎo)低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）降解，升高血漿中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平，Pcsk9基因突變會(huì)導(dǎo)致異常膽固醇血癥［7］。先前報(bào)道［8］顯示，使用Pcsk9抑制劑除了對(duì)心血管疾病有良好作用外，還可改善NAFLD，并降低LDL-C 水平。然而，關(guān)于Pcsk9如何影響NAFLD 及其調(diào)控機(jī)制的報(bào)道較少。本研究采用基因干擾技術(shù)，在高脂誘導(dǎo)的NAFLD 合并AS 大鼠中，考察Pcsk9對(duì)大鼠肝臟和主動(dòng)脈組織損傷，以及對(duì)胰島素、血脂及炎癥因子水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 40只SPF級(jí)，8周齡的雄性SD 大鼠，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量為160～200 g，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（陜）2020-001，并飼養(yǎng)于該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。使用許可證號(hào)為SYXK（陜）2020-005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批編號(hào)為No.20200521。

人腎上皮細(xì)胞系293T 細(xì)胞（武漢普諾賽生物科技有限公司），用于包裝重組慢病毒干擾質(zhì)粒。

1.1.2 主要試劑和儀器Pcsk9-短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA， shRNA） 和 shRNA- 陰 性 對(duì) 照（negative control，NC）重組慢病毒質(zhì)粒，慢病毒包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G（上海吉瑪基因公司）；RNA purification system（德國Qiagen 公司）；Superscript RNase H-逆反錄酶（美國Invitrogen 公司）；隨機(jī)六聚體（美國Sigma-Aldrich 公司）；ABI Prism 7000 系統(tǒng)（美國Applied Biosystems 公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）；ELISA 試劑盒（美國R&D Systems 公司）；10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride， PVDF）膜、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；PCSK9 抗體（#13366）、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（#14358）、P65 抗體（#8242）、p-P65 抗體（#3033）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）抗體（#11948）及GAPDH 抗體（#97166）（稀釋度均為1∶1 000，美國CST 公司）；p-TLR4 抗體（#PA5-105713，稀釋度1∶500～1∶2 000，美國Thermo Fisher公司）。

全自動(dòng)生化儀（美國Beehman公司）；γ放射免疫計(jì)數(shù)器（型號(hào)GC-2012，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；ABI Prism 7000系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；E100光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；Multiskan Sky多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組慢病毒干擾質(zhì)粒的包裝和滴度測定 將構(gòu)建好的重組慢病毒質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G 按照2∶1∶1∶1 的比例加入混勻，共同轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h 后，通過熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)滴度的慢病毒載體對(duì)照組比較確定大鼠Pcsk9基因的shRNA慢病毒載體病毒滴度。1.2.2 造模與分組 40 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型（high fat）組、shRNA-NC 干擾模型（high fat＋shRNA-NC）組及Pcsk9-shRNA 干擾模型（high fat＋Pcsk9-shRNA）組，每組10只。對(duì)照組繼續(xù)給予普通飼料，其余組給予高脂飼料（0.3%膽固醇以及20%脂肪）構(gòu)建NAFLD 大鼠模型；自由攝食，連續(xù)喂養(yǎng)14 周。實(shí)驗(yàn)期間，shRNA-NC 干擾模型組和Pcsk9-shRNA 干擾模型組分別通過腹腔注射慢病毒載體shRNA-NC 和Pcsk9-shRNA，每10 d 注射劑量為每只大鼠1×108TU/mL。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 采用RNA purification system 提取總RNA，隨后用Superscript RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體將1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Master Mix （美國Thermo Fisher公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）。檢測基因的引物如下：Pcsk9基因，正向引物5'-GCTGAGCTGCTCCAGTTTCT-3'，反向引物5'-AATGGCGTAGACACCCTCAC-3'；Gapdh，正 向 引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，反向引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。所有結(jié)果均以Gapdh為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測 計(jì)算Lee's 肥胖指數(shù)：Lee's 指數(shù)=體質(zhì)量（g）1/3×10/體長（cm）。采用放射免疫法測定空腹血清胰島素。全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血脂指標(biāo)： 高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總膽 固 醇 （total cholesterol， TC） 和 三 酰 甘 油（triacylglycerol，TAG）。

1.2.5 蘇木精-伊紅染色 末次喂食后，處死大鼠，解剖，分別將大鼠肝臟和主動(dòng)脈組織置于4%多聚甲醛緩沖液中固定后置4 ℃冰箱備用。經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明后，石蠟包埋、切片，厚度5 μm。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，依次經(jīng)過由高至低濃度梯度乙醇進(jìn)行水化。接著，用蘇木精染色2 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，稀氨水返藍(lán)20 s，伊紅染色3 min。再依次經(jīng)過由低至高濃度梯度乙醇脫水，各5 min。二甲苯透明后用中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

1.2.6 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測 根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行操作。陽性著色細(xì)胞呈棕黃色，位于細(xì)胞核，為固縮狀，高倍鏡下呈現(xiàn)碎點(diǎn)或碎塊樣。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測炎癥因子 經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈采血，于4 ℃自然凝固30 min，4 ℃、1 500×g離心10 min，分裝血清并保存于-80 ℃。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒分別檢測IL-1β、IL-6 及iNOS 的表達(dá)水平。根據(jù)說明書進(jìn)行操作，在Multiskan Sky 多功能酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法 用10%SDS-PAGE分離肝臟和主動(dòng)脈組織中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉后，蛋白質(zhì)與第一抗體（一抗）在4 ℃下孵育過夜。主要抗體如下：PCSK9、TLR4、p-TLR4、P65、p-P65、TNF-α 及GAPDH 的抗體。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP 二抗孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0 進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的定量資料采用±s 表示，多組間以單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Pcsk9基因干擾效率、肥胖指數(shù)和胰島素水平的檢測

Pcsk9-shRNA干擾模型大鼠，使Pcsk9基因沉默。RT-qPCR 和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測大鼠肝臟組織中Pcsk9的mRNA 和蛋白水平以驗(yàn)證干擾效率。如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組Pcsk9mRNA 和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（均P=0.000）；與模型組比較，high fat＋Pcsk9-shRNA 組Pcsk9的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（均P=0.000），干擾效率約76%。由此可見，成功敲減了大鼠的Pcsk9基因。表1 的檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組的肥胖指數(shù)和胰島素水平顯著升高（均P=0.000）；與模型組比較，high fat＋Pcsk9-shRNA 組肥胖指數(shù)和胰島素水平顯著下降（P=0.007，P=0.000）。

圖1 4組Pcsk9基因干擾的效率檢測Fig 1 Efficiency detection of Pcsk9 gene interference in 4 groups

表1 4組肥胖指數(shù)和胰島素水平比較Tab 1 Obesity index and insulin levels in 4 groups

2.2 大鼠肝臟損傷情況

蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）結(jié)果（圖2）所示，對(duì)照組大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布；模型組小鼠肝組織中央靜脈呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，細(xì)胞排列不均勻，結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)明顯細(xì)胞壞死。與模型組比較，high fat＋shRNA-NC 組無明顯改變；high fat＋Pcsk9-shRNA組大鼠肝組織細(xì)胞的壞死情況得到減輕。由此可見，Pcsk9干擾可以改善NAFLD 大鼠的肝損傷情況。

圖2 大鼠肝臟H-E染色(×200)Fig 2 H-E staining of rat livers(×200)

2.3 大鼠肝臟細(xì)胞的凋亡

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P=0.000）；與模型組比較，high fat＋Pcsk9-shRNA組的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P=0.000）。由此可見，Pcsk9敲減可抑制NAFLD大鼠肝臟細(xì)胞凋亡。

圖3 TUNEL檢測大鼠肝臟細(xì)胞凋亡Fig 3 Apoptosis of rat liver cells detected by TUNEL

2.4 大鼠血脂指標(biāo)的檢測

如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組的HDL-C含量顯著降低（P=0.000），而LDL-C、TC 及TAG 含量顯著升高（均P=0.000）；與模型組比較，high fat＋Pcsk9-shRNA 組 的HDL-C 含 量 顯 著 升 高（P=0.000），而LDL-C、TC 及TAG 含量顯著降低（均P=0.000）。由此可見，Pcsk9敲減可減輕NAFLD 大鼠血脂指標(biāo)的異常程度。

表2 4組大鼠血脂指標(biāo)比較Tab 2 Blood lipid indicators of rats in 4 groups

2.5 主動(dòng)脈血管壁形態(tài)學(xué)變化

顯微鏡下（圖4），對(duì)照組主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)完整，層次分界清楚，未見斑塊。模型組的動(dòng)脈內(nèi)管壁內(nèi)膜增厚，可見明顯的泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶，各層細(xì)胞脂質(zhì)浸潤，管腔內(nèi)壁厚薄不均，有類似粥樣或纖維樣的斑塊。在Pcsk9敲減模型大鼠中，主動(dòng)脈組織僅有較少斑塊形成，泡沫細(xì)胞較少，內(nèi)膜增生程度較輕。由此表明，抑制Pcsk9表達(dá)可改善NAFLD大鼠AS的病理損傷。

圖4 大鼠主動(dòng)脈血管壁H-E染色(×200)Fig 4 H-E staining of the aortic wall in rats(×200)

2.6 大鼠外周血中炎癥因子表達(dá)水平

如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組的IL-1β、IL-6 及iNOS 表達(dá)水平顯著升高（均P=0.000）；與模型組比較，high fat＋Pcsk9-shRNA 組的IL-1β、IL-6及iNOS 表達(dá)水平顯著降低（均P=0.000）。由此可見，Pcsk9敲減可抑制NAFLD 大鼠外周血中炎癥因子的表達(dá)。

表3 4組大鼠外周血中炎性因子的表達(dá)水平比較Tab 3 Expression levels of inflammatory factors in peripheral blood of rats in 4 groups

2.7 大鼠主動(dòng)脈TLR4、NF-κB P65、TNF-α 蛋白表達(dá)

蛋白印跡法檢測了大鼠主動(dòng)脈組織參與免疫炎癥通路相關(guān)的蛋白TLR4 及NF-κB P65 的磷酸化和TNF-α 的表達(dá)水平。如圖5 所示，與對(duì)照組比較，模型組的TLR4 及NF-κB P65 的磷酸化水平，TNF-α 的表達(dá)均顯著上調(diào)（均P=0.000）；與模型組比較，high fat＋Pcsk9-shRNA 組的TLR4 及NF-κB P65 的磷酸化水平，TNF-α 的表達(dá)均顯著下調(diào)（均P=0.000）。由此可見，Pcsk9干擾可抑制TLR4 及NF-κB P65 的活化，TNF-α 的表達(dá)，進(jìn)而減輕NAFLD 大鼠的炎癥反應(yīng)。

圖5 TLR4及NF-κB P65的磷酸化和TNF-α的表達(dá)水平Fig 5 Phosphorylation levels of TLR4 and NF-κB P65 and the expression of TNF-α

3 討論

NAFLD 與諸如胰島素抵抗、肥胖、血脂異常和高血壓等許多代謝性紊亂存在強(qiáng)相關(guān)性，因此，也被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的集中表現(xiàn)［9］。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、代謝和環(huán)境等因素有關(guān)。目前對(duì)于治療NAFLD 尚無特效藥，主要以適量運(yùn)動(dòng)、合理飲食和降血糖為主，并適當(dāng)給予調(diào)脂藥物治療［10］。因此，迫切需要探究治療NAFLD的相關(guān)分子靶點(diǎn)與機(jī)制。

目前研究Pcsk9在人類肝脂肪變性中的作用的研究仍然存在爭議。DEMERS等［11］研究表明在Pcsk9-/-小鼠中，Pcsk9通過下調(diào)CD36 的表達(dá)來阻止脂質(zhì)進(jìn)入肝臟。已知在肝臟中CD36通過促進(jìn)TAG 的積累和隨后的脂質(zhì)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)NAFLD 的進(jìn)展和更嚴(yán)重的非酒精性脂肪性肝炎。在肥胖或者糖尿病的情況下，Pcsk9的缺失突變可以導(dǎo)致肝臟的脂肪積累。然而也有研究［12］發(fā)現(xiàn)在正常飲食條件下，Pcsk9-/-小鼠肝臟中的幾種代償機(jī)制可能協(xié)同作用抑制肝臟脂肪變性；但在高脂代謝挑戰(zhàn)期間，Pcsk9-/-小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、纖維化、炎癥和凋亡標(biāo)志物的表達(dá)以及血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）水平顯著升高。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)干擾Pcsk9表達(dá)后NAFLD 大鼠的肥胖指數(shù)和胰島素水平降低，HDL-C 水平升高，LDL-C、TC 和TAG 水平降低。已有研究［13］表明，NAFLD 患者的脂蛋白異常代謝是導(dǎo)致AS 進(jìn)展的因素。高TAG 明顯促進(jìn)游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平增高，過多的FFA在肝臟沉積脂肪變性形成NAFLD［14］。長期的高胰島素血癥可加重NAFLD，促進(jìn)血管內(nèi)皮功能改變和平滑肌細(xì)胞功能增強(qiáng)，以及高凝血、低纖溶狀態(tài)的形成，加速AS的進(jìn)展［15］。

在肝細(xì)胞脂肪變性進(jìn)展為脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、纖維化及肝硬化的過程中，炎癥反應(yīng)起著重要的作用［16］。先前研究［17-18］表明多種化合物通過抑制NF-κB 途徑和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生保護(hù)肝臟免受損傷。我們的研究顯示，Psck9敲減可以緩解NAFLD 大鼠肝臟和主動(dòng)脈組織病理損傷，且抑制肝臟組織細(xì)胞凋亡。Psck9干擾還可抑制外周血中IL-1β、IL-6和iNOS的水平，進(jìn)而緩解NAFLD 大鼠的炎癥反應(yīng)。我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Psck9敲減可阻礙免疫炎癥相關(guān)通路蛋白TLR4和NF-κB P65的活化及炎癥因子TNF-α的表達(dá)，表明Psck9可能部分通過TLR4/NF-κB P65 通路對(duì)NAFLD大鼠起到調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，干擾Psck9基因可能通過下調(diào)TLR4/NF-κB P65磷酸化表達(dá)來緩解NAFLD 合并AS大鼠的脂質(zhì)代謝異常及炎癥反應(yīng)，改善肝臟及主動(dòng)脈損傷。當(dāng)然存在另一種可能性，即Pcsk9敲減降低了高脂飲食誘導(dǎo)的血脂異常，從而導(dǎo)致TLR4 和NF-κB P65 磷酸化表達(dá)并沒有顯著升高。