周建華，李曉華，張宏利

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海 200137

Gitelman 綜合征是由編碼噻嗪類(lèi)敏感的Na+/Cl－共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（thiazine-sensitive NaCl cotransporter，NCCT）的SLC12A3基因突變引起的常染色體隱性遺傳的腎小管疾病，以低血鉀、低血鎂、低尿鈣和繼發(fā)性醛固酮增多癥為主要特征。據(jù)報(bào)道，其發(fā)病率為1/40 000～10/40 000，在亞洲更為多見(jiàn)［1］。因其起病隱匿，在臨床中易被忽視或誤診。本研究報(bào)道1 例正常血鎂Gitelman綜合征并做文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，旨在提高臨床醫(yī)師對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和診治水平。

1 病例資料

1.1 一般病史

患者男性，33 歲，因“發(fā)熱伴四肢麻木1 d”就診于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院急診，當(dāng)時(shí)查血鉀2.78 mmol/L，給予補(bǔ)鉀治療后手足麻木緩解。后因“反復(fù)右手第二指指間關(guān)節(jié)疼痛4 年”就診于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，再次發(fā)現(xiàn)血鉀偏低，血鉀2.94 mmol/L。追問(wèn)病史，患者無(wú)乏力、手足麻木、手足抽搐、雙下肢軟癱、多尿、嗜鹽等癥狀，僅于發(fā)熱時(shí)自覺(jué)手足麻木，發(fā)熱緩解后手足麻木可自行緩解，無(wú)慢性腹瀉及嘔吐史，無(wú)噻嗪類(lèi)利尿劑及瀉藥服用史。父親母親均體健。發(fā)病以來(lái)，飲食睡眠可，大小便正常，體質(zhì)量無(wú)變化。

體格檢查：體溫36.8 ℃，脈搏80 次/min，呼吸18次/min，血壓100/70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），體質(zhì)量71.1 kg，身高165 cm，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）26.1 kg/m2。正常體型。心肺腹（-），脊柱四肢無(wú)畸形，雙下肢無(wú)水腫。四肢肌力肌張力正常，四肢活動(dòng)自如。生理反射存在，病理反射未引出。右手第二指指間關(guān)節(jié)紅腫熱痛。

實(shí) 驗(yàn) 室 檢 查： 血 鉀2.94 mmol/L， 血 鈉139 mmol/L， 血 氯100 mmol/L， 總 二 氧 化 碳31.5 mmol/L，血鈣2.43 mmol/L，血磷1.41 mmol/L，血鎂0.76 mmol/L。24 h 尿中，尿鉀39.1 mmol，尿鈉329.0 mmol，尿鈣0.6 mmol（正常值2.5～7.5 mmol），尿肌酐12.4 mmol，尿酸2 128.0 μmol，尿微量白蛋白7.7 mmol，尿蛋白84.70 mg，尿pH 5.5。立位腎素31.64 pg/mL，立位血漿醛固酮197.98 pg/mL。血尿素氮4.69 mmol/L， 血 肌 酐64.1 μmol/L， 血 尿 酸586.2 μmol/L。葡萄糖耐量試驗(yàn)示空腹葡萄糖4.80 mmol/L，2 h 血糖4.65 mmol/L，糖化白蛋白11.2%，糖化血紅蛋白5.0%。血促腎上腺皮質(zhì)激素56.84 pg/mL，血皮質(zhì)醇18.43 μg/dL。甲狀腺功能及抗體正常。自身免疫抗體13項(xiàng)正常。

泌尿系彩超、雙腎上腺增強(qiáng)CT 均未見(jiàn)異常。右手雙能CT見(jiàn)第二指指間關(guān)節(jié)旁痛風(fēng)石（圖1）。

1.2 基因診斷

使用Illumina hiseq2500 二代DNA 測(cè)序方法對(duì)SLC12A3、CLCNKB基因進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)先證者在SLC12A3基因8號(hào)外顯子和15號(hào)外顯子分別存在1個(gè)雜合突變位點(diǎn)，并分別來(lái)源于母親和父親［exon8：c.1084G>A（圖2）。exon15：c.1850A>G（圖3）］。對(duì)其進(jìn)行一代Sanger法驗(yàn)證，SLC12A3基因上游引物5'-TCAGTGGGCTGGATG-CAGAGACG-3'，下 游 引 物5'-GGGAAGAACAGGAT-TCAGGCAAGCTGG-3'，產(chǎn)物1 455 bp。結(jié)果確認(rèn)此2個(gè)位點(diǎn)突變。此2個(gè)突變使相鄰的2 個(gè)氨基酸密碼子發(fā)生錯(cuò)義突變：p.G362S，p.Q617R。2種變體均位于NCCT蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中一種變體位于羧基末端區(qū)域（圖4）。在dbSNP135及1000 genomes project數(shù)據(jù)庫(kù)中，突變p.G362S 未見(jiàn)記錄，突變p.Q617R 頻率極低。而在gnomAD 正常人數(shù)據(jù)庫(kù)（ACMG-PM2）里，本研究發(fā)現(xiàn)的2個(gè)變異均未見(jiàn)記錄，迄今為止也沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。根據(jù)ACMG基因變異致病性評(píng)估指南，這2個(gè)變異被分類(lèi)為臨床意義未明變異。

圖2 SLA12A3基因外顯子8檢測(cè)到的致病突變c.1084G>AFig 2 Pathogenic mutation c.1084G>A detected in exon 8 of SLA12A3 gene

圖3 SLA12A3基因外顯子15檢測(cè)到的致病突變c.1850A>GFig 3 Pathogenic mutation c.1850A>G detected in exon 15 of SLA12A3 gene

圖4 預(yù)測(cè)NCCT突變的拓?fù)涠ㄎ籉ig 4 Predicted topological localization of NCCT mutations

1.3 計(jì)算機(jī)輔助鑒別有害的變異體

SIFT 和PROVEAN 軟件是2款用于評(píng)估研究中發(fā)現(xiàn)的外顯子區(qū)變異是否有損于蛋白質(zhì)功能的常用工具程序。SIFT 軟件輸出的分值區(qū)間為0～1，當(dāng)變異體得分≤0.05 時(shí)判定為有害的（damaging），>0.05 時(shí)則判定為可接受的（tolerated）。PROVEAN 軟件對(duì)位點(diǎn)保守性的評(píng)分若≤-2.5， 則判定為有害的影響（deleterious）。本研究中發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變p.G362S，應(yīng)用SIFT 軟件得分為0，應(yīng)用PROVEAN 軟件得分為-5.44，被判定為有害的變異；錯(cuò)義突變p.Q617R，應(yīng)用SIFT 軟件得分為0，應(yīng)用PROVEAN 軟件得分為-3.86，被判定為有害的變異。

1.4 基因突變后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)將SLC12A3基因運(yùn)用Swiss model預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變異后將會(huì)使其三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（圖5）。

圖5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig 5 Predicted structure of the protein

1.5 診治及隨訪(fǎng)

診斷：①Gitelman綜合征。②痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期。治療：①補(bǔ)鉀治療。予口服氯化鉀緩釋片1.0 g/次，3 次/d。②消炎止痛治療。予秋水仙堿片0.5 mg/次，3 次/d，疼 痛 緩 解 后 調(diào) 整 為0.5 mg/次，1次/d。隨訪(fǎng)：患者1 d后右手指間關(guān)節(jié)疼痛緩解，1周后復(fù)查血鉀3.10 mmol/L，2 周后加用苯溴馬隆膠囊50 mg/次，1次/d，1個(gè)月后復(fù)查血鉀3.22 mmol/L，血鎂0.80 mmol/L，血尿酸287.0 μmol/L，患者無(wú)不適。

2 討論

Gitelman 綜合征又稱(chēng)家族性低鉀低鎂血癥，臨床表現(xiàn)有嗜鹽、抽搐、肌肉無(wú)力、乏力，多尿、關(guān)節(jié)痛、軟骨鈣質(zhì)沉著癥、生長(zhǎng)遲緩等等，其臨床表現(xiàn)主要與低鉀血癥和低鎂血癥有關(guān)。而SLC12A3的雙等位基因失活突變確定是確診Gitelman 綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。也有報(bào)道［3］稱(chēng)18%～40%的疑似Gitelman綜合征患者僅發(fā)現(xiàn)了單等位基因突變，不符合常染色體隱性遺傳規(guī)律；推測(cè)與基因重組后出現(xiàn)大片段的結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，而目前二代測(cè)序的方法對(duì)于大片段的缺失或重復(fù)缺乏相應(yīng)的檢測(cè)敏感性。

本例Gitelman綜合征患者血鎂水平正常，并且無(wú)乏力、嗜鹽、抽搐、多尿等相關(guān)臨床癥狀，僅于發(fā)熱時(shí)出現(xiàn)四肢麻木，臨床相對(duì)少見(jiàn)，需要與Bartter綜合征相鑒別。本病例低尿鈣以及二代測(cè)序未發(fā)現(xiàn)CLCNKB基因突變的臨床特點(diǎn)均支持Gitelman綜合征診斷。有報(bào)道稱(chēng)，Gitelman綜合征的臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度與血鎂的水平呈負(fù)相關(guān)［4-5］。血鎂水平降至0.5 mmol/L 以下才導(dǎo)致顯著的癥狀和體征，臨床表現(xiàn)包括神經(jīng)肌肉過(guò)度興奮、震顫、抽搐和昏迷［6］。腕部痙攣或手足抽搐被認(rèn)為是由于低鎂血癥引起［7］，血鎂正常的Gitelman綜合征患者表現(xiàn)為較低頻率的腕部痙攣或手足抽搐，以及較輕的電解質(zhì)紊亂，代謝性堿中毒和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS） 的 激 活［4］。本病例患者無(wú)相關(guān)自覺(jué)臨床癥狀，考慮與血鎂水平正常有關(guān)。已有報(bào)道［8-11］顯示8%～22%的Gitelman 綜合征患者血鎂正常。目前，Gitelman綜合征低鎂血癥的發(fā)病機(jī)制仍不明確。鎂是細(xì)胞內(nèi)第二豐富的陽(yáng)離子，在多種生物活性中發(fā)揮著重要作用。血鎂濃度與腸吸收密切相關(guān)，主要由腎排泄調(diào)節(jié)。雖然遠(yuǎn)曲小管通過(guò)瞬時(shí)受體電位蛋白酶抑制素6 亞型（transient receptor potential cation channel subfamily M，member 6，TRPM6）介導(dǎo)只吸收超濾液中5%～10%的鎂離子，但它是吸收鎂離子的最后一個(gè)部位，起到調(diào)節(jié)尿鎂濃度的作用，因此它決定了最終的血鎂濃度。TRPM6突變的發(fā)現(xiàn)是家族性低鎂血癥繼發(fā)性低鈣血癥的原因，闡明了TRPM6 可滲透性通道缺陷表達(dá)的特征［12］。NIJENHUIS 等［13］在一項(xiàng)對(duì)NCCT 缺陷小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)曲小管TRPM6 的表達(dá)減少可能是造成低鎂血癥的原因。JIANG 等［4］在一個(gè)32 例的Gitelman綜合征患者的隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，低鎂血癥組TRPM6 表達(dá)較正常對(duì)照組明顯下調(diào)，而正常血鎂組TRPM6 表達(dá)較正常對(duì)照組無(wú)顯著差異。也有研究表明，性別可能影響Gitelman 綜合征患者的血清鎂水平。LIN 等［14］報(bào)道了2 個(gè)病例證實(shí)為Gitelman 綜合征的家系，其中男性患者血鎂正常，而具有相同突變的女性患者血鎂過(guò)低。也有學(xué)者認(rèn)為，Gitelman綜合征患者的血漿游離鎂濃度比總鎂濃度更有意義。TOSI等［15］發(fā)現(xiàn)血漿總鎂濃度正常的Gitelman綜合征患者血漿游離鎂濃度是降低的，且血漿游離鎂濃度與血漿碳酸氫鹽之間存在顯著相關(guān)性，但血漿游離鎂濃度因檢測(cè)手段等問(wèn)題未能在臨床廣泛開(kāi)展。

本病例的另一個(gè)特點(diǎn)是合并痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。已有報(bào)道顯示，Gitelman 綜合征合并假性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，考慮為軟骨鈣質(zhì)沉著癥，這可能是因?yàn)槟蜮}排泄減少，增加了鈣鹽結(jié)晶沉積的概率，同時(shí)因?yàn)榇x性堿中毒及低鎂血癥導(dǎo)致焦磷酸酶活性下降，阻礙焦磷酸水解為無(wú)機(jī)的磷酸鹽，加重焦磷酸鹽結(jié)晶，沉積于關(guān)節(jié)周?chē)⒁痍P(guān)節(jié)痛［16］。但Gitelman 綜合征合并痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎尚未見(jiàn)報(bào)道。MAIOLINO 等［17］檢測(cè)了25 例Gitelman 綜合征患者的血尿酸水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者的血尿酸水平均在正常范圍，并且男性血尿酸平均水平高于女性。也有報(bào)道［18-19］顯示Gitelman綜合征患者合并低血尿酸水平。本例患者合并高尿酸血癥，24 h 尿尿酸水平為2 128.0 μmol，尿酸排泄分?jǐn)?shù)（血肌酐×24 h 尿酸/血尿酸×24 h 尿肌酐） 為1.88%，提示患者為尿酸排泄減少型高尿酸血癥，考慮可能仍與NCCT 失活有關(guān)?；颊哌h(yuǎn)曲小管NCCT 失活，致遠(yuǎn)曲小管NaCl 重吸收減少，血容量下降，腎血流量代償性增加，近曲小管NaCl 和尿酸鹽重吸收增加。而鈉和尿酸鹽關(guān)聯(lián)的具體機(jī)制尚不完全明確，有研究表明［20］，血容量不足和限鹽攝入均可增加尿酸鹽的重吸收，可能與近曲小管鈉和尿酸鹽的重吸收之間存在平行關(guān)系有關(guān)。尿酸鹽通過(guò)多種陰離子交換蛋白進(jìn)入細(xì)胞，包括尿酸鹽-羥基交換蛋白和尿酸鹽-乳酸交換蛋白，這2 個(gè)過(guò)程都依賴(lài)于鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)。而管腔膜上的Na+-H+交換蛋白負(fù)責(zé)大多數(shù)的近端碳酸氫鹽重吸收。當(dāng)鈉重吸收增加時(shí)，Na+-H+交換增加，碳酸氫鹽重吸收增加，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境比管腔內(nèi)的堿性更強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)較高的羥基濃度為羥基排出提供了有利梯度，羥基排出進(jìn)而可促進(jìn)尿酸鹽重吸收。同樣，當(dāng)鈉重吸收增加時(shí)，管腔膜上的鈉-乳酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可介導(dǎo)乳酸進(jìn)入細(xì)胞，這些乳酸隨后通過(guò)尿酸鹽-乳酸交換蛋白返回管腔，而尿酸鹽被重吸收。

Gitelman 綜合征的基因型中，純合子基因型僅占18%，雜合子基因型占45%，復(fù)雜雜合子基因型占67%［21］。其基因型和表型的相關(guān)性研究有助于進(jìn)一步了解NCCT 的功能，并為臨床診治提供參考。然而，基于不同研究的結(jié)果的不一致性，目前Gitelman綜合征基因型與表型之間的關(guān)系尚不清楚。1996 年，Simon 等克隆了SLC12A3的cDNA，首次對(duì)人類(lèi)NCCT進(jìn)行了編碼，并將其定位在具有26個(gè)獨(dú)立外顯子的人染色體16q13 上。NCCT 是腎遠(yuǎn)曲小管的主要離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，由1 021 個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和較長(zhǎng)的氨基和羧基端?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)［22］SLC12A3基因突變類(lèi)型共有529 種，以錯(cuò)義突變及無(wú)義突變最多見(jiàn)，缺失突變和剪接位點(diǎn)突變較常見(jiàn)，插入突變較少見(jiàn)，另外還有插入缺失突變和復(fù)雜的基因重排等。一項(xiàng)納入了137 例中國(guó)Gitelman 綜合征患者的研究顯示［23］，在發(fā)現(xiàn)的90 個(gè)突變中，錯(cuò)義突變占72%以上。T60M 及D486N 是中國(guó)患者最常見(jiàn)的氨基酸突變［9，11］，而IVS9+1G>T 是報(bào)道最多的歐洲人群中常見(jiàn)的突變［24］。在已發(fā)現(xiàn)的突變中，運(yùn)用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)僅對(duì)其中大約50 個(gè)突變進(jìn)行了功能分析。研究發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)、突變類(lèi)型、突變個(gè)數(shù)以及突變位置均影響臨床表型。比如一些關(guān)鍵位點(diǎn)（糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)）的突變可以直接影響NCCT 的活性及穩(wěn)定性［25-27］，一些特殊位點(diǎn)的突變臨床表型相對(duì)較輕，剪切突變、無(wú)義突變、移碼突變、無(wú)功能性錯(cuò)義突變導(dǎo)致的臨床表型較重［28］，攜帶2個(gè)突變的患者有更重的表型［4，29］，含有深部?jī)?nèi)含子突變的患者有相對(duì)更重的表型［28］。我們首次鑒定了復(fù)合雜合子變異體（c.1084G>A，p.G362S 和c.1850A>G，p.Q617R）?；颊叩哪赣H是一個(gè)變異（c.1084G>A）的攜帶者，而他的父親是另一個(gè)變異的攜帶者（c.1850A>G）。然而，患者是家系中唯一表現(xiàn)出明顯臨床表現(xiàn)和患有Gitelman 綜合征的成員。此類(lèi)病例以前曾有報(bào)道［21，30］。在這些研究中，先證者攜帶復(fù)合雜合子變異體，其中一個(gè)變異體遺傳自母親，另一個(gè)遺傳自父親。然而，他們的父母都很健康。而該患者有正常血鎂和高尿酸血癥，是否提示新的突變位點(diǎn)與此有關(guān)呢？JIANG 等［4］的研究顯示：7 例正常血鎂患者攜帶13 個(gè)突變等位基因，其中12 個(gè)為胞內(nèi)域突變，1 個(gè)為跨膜域突變，無(wú)胞外域突變；而25 例低鎂血癥患者有46 個(gè)突變等位基因，其中26 個(gè)位于胞內(nèi)域，15 個(gè)位于跨膜域，5 個(gè)位于胞外域；結(jié)果提示正常血鎂患者胞內(nèi)域突變百分比明顯高于低鎂血癥患者。本例患者SLC12A3基因的2 個(gè)突變位點(diǎn)編碼的相應(yīng)NCCT 氨基酸一個(gè)位于胞內(nèi)域，一個(gè)位于跨膜域，與以往研究一致。然而，此新的突變位點(diǎn)與正常血鎂及高尿酸血癥的關(guān)系還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外功能學(xué)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)和揭示。