張懿明，毛良浩，江 攀，倪晨烈，李 建，尹正宇，仲新宇，張 兵，李大鵬

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一種常見的原發(fā) 性惡性骨腫瘤，起源于間充質(zhì)組織，在兒童和青少年中發(fā)病率較高，具有高侵襲性、易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點［1］。通過新輔助化療、手術(shù)、化療及生物治療的綜合療法，未轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的總生存率由不足20%逐漸提高到70%；然而，轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的總體預(yù)后仍然較差，總生存率僅為20%左右［2］。分子生物學(xué)的發(fā)展為骨肉瘤的診斷和治療提供了新見解，研究發(fā)現(xiàn) TP53、RB1、NOTCH1、REQL4、INK4a的突變及TGF-β、c-Myc和IGF通路的失調(diào)與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)密切相關(guān)［3，4］，然而具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步挖掘。高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析相結(jié)合，有助于更好地了解骨肉瘤潛在的分子機(jī)制，尋找治療靶點，從而延長骨肉瘤患者的生存時間［5，6］。有研究通過綜合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RPUSD1基因高表達(dá)與骨肉瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，并可能通過細(xì)胞代謝等相關(guān)通路發(fā)揮作用，為進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗提供依據(jù)［7］。本研究分別分析了GSE11414和GSE14359芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集，篩選骨肉瘤和成骨細(xì)胞之間的差異基因。通過GO和KEGG通路富集分析進(jìn)一步探索兩個數(shù)據(jù)集中共表達(dá)差異基因的潛在生物學(xué)功能。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape挖掘關(guān)鍵基因，最后使用LOGpc數(shù)據(jù)庫評估關(guān)鍵基因的預(yù)后價值，以期為骨肉瘤防治和研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

兩個芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE11414和GSE14359）從美國國家生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information,NCBI）的基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus,GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲得。GSE14359數(shù)據(jù)集由1個人原代成骨細(xì)胞樣本、5個普通型骨肉瘤冰凍樣本以及4個骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移腫瘤樣本組成，每個樣本均有2個復(fù)本，基于GPL96分析平臺（［HGU133A］ Affymetrix Human Genome U133A Array）。作者選擇了其中的10個常規(guī)骨肉瘤樣本和2個非腫瘤原代成骨細(xì)胞樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析。GSE11414數(shù)據(jù)集包含1個正常人成骨細(xì)胞，1個U2OS骨肉瘤細(xì)胞系，1個MG63骨肉瘤細(xì)胞系的測序結(jié)果，每個樣本有2個復(fù)本，數(shù)據(jù)集基于GPL6244芯片分析平臺（［HuGene-1_0-st］ Affymetrix human Gene 1.0 ST Array［transcript(Gene)version］）。GSE11414中的所有樣本均被納入本研究進(jìn)行分析。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

利用GEO2R在線分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分別對兩個芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE11414和GSE14359）中骨肉瘤樣本和正常成骨細(xì)胞樣本之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|>1且adjust P值<0.05。logFC>1的差異基因被認(rèn)為是上調(diào)基因，logFC<-1的差異基因被認(rèn)為是下調(diào)基因。利用韋恩圖在線網(wǎng)頁工具（bioinformatics.psb.ugenta.be/webtools/Venn/） 獲取兩個芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集之間的共表達(dá)差異表達(dá)基因。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

為了進(jìn)一步揭示共表達(dá)差異基因的重要功能和生物學(xué)途徑，作者對其進(jìn)行了GO功能和KEGG通路富集分析。GO是一種常用的基因注釋和功能基因組學(xué)分析方法，包括生物過程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和細(xì)胞成分（cel?lular component,CC）［8］。 KEGG （http://www.genome.jp/）是一個廣泛使用的數(shù)據(jù)庫，存儲了大量關(guān)于基因組信息與生物途徑、化學(xué)物質(zhì)、疾病和藥物的數(shù)據(jù)［9］。利用 R 軟件中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“ggplot2”程序包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析及可視化，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于篩選的共表達(dá)差異基因，作者利用STRING數(shù) 據(jù) 庫 （STRING,version 11.0,http://string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)，并由Cytoscape軟件可視化，蛋白互作得分>0.15為篩選標(biāo)準(zhǔn)（滿分為1）。此外差異表達(dá)基因的logFC值也被導(dǎo)入Cytoscape中以顯示基因上/下調(diào)節(jié)狀態(tài)。利用Cytoscape中的CytoHubba插件篩選關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步分析。

1.5 關(guān)鍵基因預(yù)后分析

LOGpc數(shù)據(jù)庫（http://bioinfo.henu.edu.cn）可提供查詢分析多種癌癥的預(yù)后生存數(shù)據(jù)，其數(shù)據(jù)主要來源 GEO和 TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）等數(shù)據(jù)庫［10］。將由CytoHubba篩選得到的關(guān)鍵基因輸入LOGpc數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行生存分析，選擇骨肉瘤GSE39058數(shù)據(jù)集探究關(guān)鍵基因表達(dá)水平與骨肉瘤患者無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival,RFS）的關(guān)系，所有參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因篩選

以|log2FC|>1且adjust P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從GSE11414數(shù)據(jù)集中共得到735個差異基因，其中262個上調(diào)基因，473個下調(diào)基因，從GSE14359中共篩選得到1 376個差異基因，其中791個上調(diào)基因，585個下調(diào)基因；隨后，通過Venn分析，在兩個數(shù)據(jù)集之間篩選得到111個共表達(dá)差異基因，其中28個基因顯著上調(diào)（圖1a），83個基因顯著下調(diào)（圖1b）。

2.2 GO和KEGG通路富集分析

為了探索共表達(dá)差異基因潛在的生物學(xué)功能，本研究使用R軟件進(jìn)行了GO注釋和KEGG通路富集分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GO富集分析結(jié)果顯示111個共表達(dá)差異基因參與的生物學(xué)進(jìn)程有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞基質(zhì)粘附等；分子功能則主要富集于整合素結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成；細(xì)胞成分方面，差異基因主要存在于包含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、溶酶體管腔、空泡腔（圖1c）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示這些差異基因主要富集于p53信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）信號通路及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）信號通路等（圖1d）。

圖1 來自兩個基因數(shù)據(jù)集（GSE14359和GSE11414）共表達(dá)差異基因的韋恩圖及功能富集結(jié)果 1a:GSE14359和GSE11414數(shù)據(jù)集中共識別28個上調(diào)的共表達(dá)差異基因 1b:GSE14359和GSE11414數(shù)據(jù)集中共識別83個下調(diào)的共表達(dá)差異基因 1c:111個共表達(dá)差異基因GO富集分析氣泡圖，每個氣泡大小代表富集的基因數(shù)量，而顏色由藍(lán)到紅對應(yīng)P值由大到小 1d:111個共表達(dá)差異基因KEGG通路富集分析氣泡圖，每個氣泡大小代表富集的基因數(shù)量，而顏色由藍(lán)到紅對應(yīng)P值由大到小

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

蛋白互作得分>0.15為篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測了共表達(dá)差異基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape軟件進(jìn)行后續(xù)分析。整個PPI網(wǎng)絡(luò)由104個節(jié)點和778條邊組成，紅色的節(jié)點表示上調(diào)的基因，綠色的節(jié)點表示下調(diào)的基因（圖2a）。應(yīng)用Cyto?Hubba插件根據(jù)MCC法篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的關(guān)鍵基因：纖連蛋白1（fibronectin 1,FN1）、血小板凝血酶蛋白1（thrombospondin-1,THBS1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6,IL-6）、纖溶酶原激活物抑制因子1（serine protease inhibitor,clade E member 1,SER?PINE1）、窖蛋白1（caveolin-1,CAV1）、基質(zhì)金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14,MMP14）、彈性蛋白（elastin,ELN）、類胰島素生長因子結(jié)合蛋白3（Insu?lin-like growth factor-binding protein 3,IGFBP3）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1）、細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子1A（cyclindependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A）（圖2b）。

2.4 關(guān)鍵基因預(yù)后分析

通過LOGpc數(shù)據(jù)庫對篩選得到的關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，驗證其在骨肉瘤中的預(yù)后價值。結(jié)果表明 THBS1（P<0.001，HR=10.930） 和 IGFBP3（P=0.043，HR=3.234）高表達(dá)與骨肉瘤患者的RFS負(fù)相關(guān)（圖 2c,2d）。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的生存分析 2a:PPI網(wǎng)絡(luò)包含111個差異基因，每個節(jié)點代表一個蛋白質(zhì)，每條線代表蛋白質(zhì)之間的相互作用。紅色節(jié)點代表上調(diào)基因，綠色節(jié)點代表下調(diào)基因 2b:通過CytoHubba插件篩選得到的10個關(guān)鍵基因及其相互作用關(guān)系，每條線代表蛋白質(zhì)之間的相互作用 2c:生存分析顯示THBS1高表達(dá)與骨肉瘤患者較短的無復(fù)發(fā)生存期有關(guān) 2d:生存分析顯示IGFBP3高表達(dá)與骨肉瘤患者較短的無復(fù)發(fā)生存期有關(guān)

3 討論

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的骨腫瘤，大多數(shù)發(fā)生在長骨的干骺端，其特征是骨樣沉積改變和高轉(zhuǎn)移率［11］。目前，骨肉瘤患者的標(biāo)準(zhǔn)治療策略是新輔助化療（術(shù)前）、手術(shù)切除（截肢或最常見的保肢手術(shù)）和輔助化療（術(shù)后）［12］。然而，在現(xiàn)有的治療方案下，轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的10年生存率仍低于20%，迫切需要新的治療策略［13］。近年來，生物信息學(xué)的發(fā)展為骨肉瘤的早期診斷和治療提供了新見解［14，15］。本研究通過分析 GSE11414 和 GSE14359 芯片數(shù)據(jù)，對骨肉瘤和成骨細(xì)胞之間的差異基因進(jìn)行功能富集分析，PPI網(wǎng)絡(luò)分析以及預(yù)后分析，最終篩選了10個關(guān)鍵基因。

GO和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示差異基因主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)組織、整合素結(jié)合、包含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、p53及TGF-β信號通路。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供物理支持、調(diào)節(jié)組織發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，還參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、免疫逃逸［16］。而整合素是連接細(xì)胞外基質(zhì)最重要的粘附分子受體，參與細(xì)胞粘附及信號傳導(dǎo)，可與受體酪氨酸激酶協(xié)同作用通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3-kinase/pro?tein kinase B,PI3K/AKT）通路促進(jìn)癌細(xì)胞的有絲分裂和增殖［17］。p53是研究最充分的腫瘤抑制因子之一，參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、鐵死亡、衰老、DNA修復(fù)等多種細(xì)胞過程［18］。而TGF-β在腫瘤中具有雙重作用，既可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡來抑制腫瘤的發(fā)生；又能刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，作用于腫瘤微環(huán)境間接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［19，20］。由此可見差異基因可能通過p53和TGF-β信號通路參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，可以通過進(jìn)一步的實驗探究具體機(jī)制。

在對差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析中，篩選得到10個關(guān)鍵基因，其中THBS1和IGFBP3高表達(dá)與骨肉瘤患者的RFS負(fù)相關(guān)。THBS1是血小板凝血酶蛋白家族成員之一，可通過THBS1/CD36/vasculostatin信號通路促進(jìn)血管抑素的表達(dá)，抑制骨肉瘤血管生成及腫瘤生長［21］。然而 Hu 等［22］發(fā)現(xiàn) THBS1 增加了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)并通過激活FAK信號通路促進(jìn)骨肉瘤的遷移、侵襲和肺轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)THBS1高表達(dá)與骨肉瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)。由此作者推測THBS1在骨肉瘤中可能發(fā)揮抑癌和促癌的雙重作用，需要進(jìn)一步實驗闡明THBS1的生物學(xué)功能。而IGFBP3主要受p53調(diào)控，是循環(huán)中類胰島素生長因子的主要載體，其在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平的破壞與多種癌癥的病理生理學(xué)有關(guān)［23］。Long 等［24］研究表明circ_0000285可以通過miR-409-3p/IGFBP3軸促進(jìn)骨肉瘤的增殖，侵襲并抑制其凋亡。此外IGFBP-3還可通過PI3K/AKT和活化蛋白-1信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移，同時上調(diào)VCAM1表達(dá)水平［25］。以上研究結(jié)果提示IGFBP3可能與骨肉瘤的不良預(yù)后有關(guān)，與本研究的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過綜合生物信息學(xué)分析為闡明骨肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供了一系列關(guān)鍵基因和通路。但尚需進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗來證實這些關(guān)鍵基因在人骨肉瘤組織中的表達(dá)、具體功能及機(jī)制，以期為骨肉瘤靶向藥物的研發(fā)和聯(lián)合治療提供新思路。