逄 婷，劉志偉，鄒茂賢，葉志權(quán)，胡淑芬

廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 511400

急性髓系白血病(AML)是一組在臨床及遺傳學(xué)上均具有異質(zhì)性的惡性血液系統(tǒng)疾病。免疫表型分析是判斷腫瘤細(xì)胞來源、分化程度以及預(yù)后的重要手段，而開展白血病相關(guān)基因突變檢測，則是對AML患者進(jìn)行精確分級診斷、預(yù)后評估以及靶向治療等的重要依據(jù)[1]。核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突變是成人AML中最常見的突變之一[2]。目前發(fā)現(xiàn)的該基因突變絕大多數(shù)是位于NPM1基因第12號外顯子上的插入突變[3]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南將單獨(dú)NPM1基因突變的正常核型AML患者列為預(yù)后良好組。為了探討NPM1基因突變AML患者是否存在獨(dú)特的臨床及血液學(xué)特征，本研究回顧性分析了70例初診AML患者NPM1基因突變的發(fā)生情況、免疫表型、臨床表現(xiàn)和血液學(xué)特征，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2021年5月在本院就診的70例初診AML患者作為研究對象，其中男40例、女30例，年齡14～87歲、中位年齡58歲。所有患者均完成血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)等相關(guān)檢查，并符合白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)。按照法、美、英(FAB)協(xié)作組診斷分型標(biāo)準(zhǔn)將AML分為M1～M6型。

1.2方法

1.2.1血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢查 征得患者知情同意，抽取骨髓及外周血標(biāo)本制作涂片，涂片經(jīng)瑞氏染色后，在Olympus顯微鏡下分類計數(shù)200個(骨髓片)及100個(血片)有核細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行分類計數(shù)。利用4色熒光(熒光素分別為FITC、PE、APC、PerCP)免疫標(biāo)記法進(jìn)行免疫分型檢測。所檢測的髓系抗原有CD15、CD13、CD33、CD14、CD64、CD71、CD117、CD11b、MPO；T淋巴細(xì)胞抗原有CD3、CD8、CD4、CD2，CD7、CD5；B淋巴細(xì)胞抗原有CyCD79a、CD10、CD19、CD20，CD22；NK細(xì)胞抗原有CD56；其他非特異系列抗原有CD34、CD38、HLA-DR等。利用CD45/SSC設(shè)門分析原始或幼稚細(xì)胞群抗原表達(dá)特點(diǎn)，通常以比例≥20%為該抗原表達(dá)陽性，MPO≥10%為陽性。

1.2.2PCR檢測NPM1基因突變 (1)基因組DNA提取。采用全自動核酸提取儀(Smart32)標(biāo)準(zhǔn)抽提法，嚴(yán)格按說明書要求提取骨髓細(xì)胞DNA，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)NPM1基因突變檢測。參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計NPM1基因第12外顯子引物，并由北京六合華大基因科技有限公司合成，F(xiàn)：5′-TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3′；R：5′-CAAGACTATTTGCCATTCCTAAC-3′。PCR總體系25 μL，包含模板DNA 4 μL、正反向引物各1.5 μL、Pre-Mix Taq 12.5 μL(TaKaRa)、Betaine 5.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共33個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(110 V，10 min)，紫外燈下觀察目的條帶約為560 bp。產(chǎn)物用5′-AAAAGGACAGCCAGATATCA AC-3′測序引物進(jìn)行直接測序(由廣州天一輝遠(yuǎn)基因公司完成)，在測序引物后70～100 bp出現(xiàn)雙峰的標(biāo)本為NPM1基因突變陽性標(biāo)本。

2 結(jié) 果

2.1AML患者免疫表型分析結(jié)果 70例AML患者FAB分型分別為M1型6例、M2型18例、M3型11例、M4型14例、M5型20例、M6型1例，其中，M5型AML發(fā)病率最高，占28.57%，其他依次為M2型(25.71%)、M4型(20.00%)、M3型(15.71%)、M1型(8.57%)、M6型(1.43%)。髓系抗原表達(dá)率由高到低依次為CD13(97.14%)、CD33(94.29%)、CD117(82.86%)、CD15(62.86%)、CD71(61.43%)、CD64(60.00%)、CD11b(31.43%)、CD14(8.57%)。非特異系列抗原表達(dá)率由高到低依次為CD38(100.00%)、HLA-DR(77.14%)、CD34(55.71%)。44例(62.86%)AML患者伴有淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)，表達(dá)率由高到低依次為CD7(35.71%)、CD4(27.14%)、CD2(17.14%)、CD22(11.43%)、CD19(1.43%)，其中12例為T淋巴細(xì)胞抗原共表達(dá)(CD2與CD4共表達(dá)6例，CD2與CD7共表達(dá)3例，CD4與CD7共表達(dá)3例),7例為T、B淋巴細(xì)胞抗原混合表達(dá)(CD7與CD22混合表達(dá)3例，CD4、CD7與CD22混合表達(dá)2例，CD2與CD19混合表達(dá)1例，CD4與CD22混合表達(dá)1例)。各AML亞型均高表達(dá)CD38、CD13、CD33，而CD34及HLA-DR在M3型患者中的表達(dá)率最低，CD14僅在M4型和M5型中表達(dá)，見表1。

表1 70例AML患者各種抗原表達(dá)情況(n)

2.2NPM1基因突變分析 70例初診AML患者直接測序后共13例(18.57%)檢出NPM1基因突變，可見在測序開始后70～100 bp呈現(xiàn)雙峰，57例未檢出NPM1基因突變(圖1A)。分析發(fā)現(xiàn)其中10例患者為A型突變(圖1B)，表現(xiàn)為c.860_863處重復(fù)TCTG 4個堿基，導(dǎo)致NPM蛋白羧基(C)末端讀碼框移。1例患者為B型突變(圖1C)，表現(xiàn)為c.863_864處插入CATG 4個堿基，2例患者為D型突變(圖1D)，表現(xiàn)為c.863_864處插入CCTG 4個堿基。除M3型、M6型外，M1、M2、M4、M5型均有NPM1突變發(fā)生，該突變在各型患者中的發(fā)生率分別為M1型50.00%(3/6)、M2型11.11%(2/18)、M4型28.57%(4/14)、M5型20.00%(4/20)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NPM1基因突變在非AML-M3的檢出率為22.03%(13/59)。

注：A為無NPM1基因突變測序圖；B為A型突變直接測序圖；C為B型突變直接測序圖；D為D型突變直接測序圖。箭頭示突變插入位點(diǎn)。

2.3不同NPM1基因突變患者血液學(xué)及免疫表型特點(diǎn)分析 70例患者按照NPM1基因突變檢測結(jié)果分為NPM1陽性組(13例)和NPM1陰性組(57例)。NPM1陽性組AML患者初診時白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)、乳酸脫氫酶(LDH)及骨髓原始或幼稚細(xì)胞比例均高于NPM1陰性組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NPM1陽性組CD34陽性率(15.38%)低于NPM1陰性組(64.91%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余免疫表型及年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 70例初診AML患者血液學(xué)及免疫表型分析

組別nCD34+(n/n)CD117+(n/n)HLA-DR+(n/n)CD15+(n/n)CD64+(n/n)CD4+(n/n)CD56+(n/n)NPM1陽性組132/1310/139/136/136/135/136/13NPM1陰性組5737/5748/5745/5738/5736/5714/5715/57t/χ2/Z10.5240.0490.1501.1301.2750.4511.152P0.0010.8250.6990.2880.2590.5020.283

3 討 論

急性白血病(AL)是由于造血干或祖細(xì)胞突變導(dǎo)致的一組具有異質(zhì)性的惡性血液系統(tǒng)疾病。FAB分型是國際上較為統(tǒng)一的診斷AL的早期分型方法。血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以明顯提升AL的診斷準(zhǔn)確性。本研究70例AML患者中，最常表達(dá)的髓系抗原為CD13(97.14%)和CD33(94.29%)，是鑒別急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和AML的重要免疫標(biāo)志，其余髓系抗原表達(dá)率由高到低依次為CD117、CD15、CD71、CD64、CD11b、CD14。44例AML患者伴有淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)，其中部分病例存在T淋巴細(xì)胞抗原共表達(dá)或T、B淋巴細(xì)胞抗原混合表達(dá)的情況。非特異系列抗原在本研究AML患者中的表達(dá)率依次為CD38(100.00%)、HLA-DR(77.14%)、CD34(55.71%)。在M3型患者中CD34、HLA-DR及CD11b的表達(dá)率較低，與文獻(xiàn)[5]報道基本一致。另外，11例M3型患者(PML-RARa融合基因陽性)均未檢測到NPM1基因突變，說明該基因突變與融合基因之間無重疊現(xiàn)象[6]。

人類NPM1基因位于5q35上，編碼由294個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。NPM1基因突變主要發(fā)生于第12號外顯子，突變具有遺傳異質(zhì)性，其中以A型突變最為常見。本研究70例初診AML患者直接測序后共檢出13例NPM1基因突變陽性者，表現(xiàn)在測序開始后70～100 bp呈現(xiàn)雙峰，其中10例患者為A型突變(76.92%)，1例患者為B型突變，2例患者為D型突變。上述突變均為移碼突變，可造成NPM1羧基末端氨基酸序列發(fā)生變化，原來的7個氨基酸殘基被11個殘基所替代(替代后為CLAVEEVSLRK)。這種突變影響了羧基末端核仁定位信號(NoLS)，并導(dǎo)致NPM1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)[7]，AML的發(fā)生可能與在胞質(zhì)中異常聚集的NPM1相關(guān)聯(lián)。VAN DER LEE等[8]認(rèn)為NPM1突變后產(chǎn)生的NPM1羧基末端11個氨基酸殘基可以作為一種免疫治療的新抗原，通過證實(shí)一種肽(HLA-A*02:01結(jié)合CLAVEEVSL)可通過T細(xì)胞受體基因轉(zhuǎn)移有效靶向AML，表明突變NPM1有望成為相關(guān)AML的免疫治療新靶點(diǎn)。

本研究顯示，NPM1陽性組AML患者初診時年齡偏大，女性比例較高，WBC、PLT、LDH及骨髓原始或幼稚細(xì)胞比例高于NPM1陰性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。免疫表型分析顯示，NPM1陽性組CD34陽性率低于NPM1陰性組(P<0.05)，其余免疫表型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這可能與AML患者樣本量偏少及可能存在其他基因突變[如FMS樣的酪氨酸激酶3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列(FLT3-ITD)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)等]的影響有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)[9]報道，NPM1突變常與DNMT3A、FLT3-ITD突變共同發(fā)生，它們協(xié)同作用而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。使用變異等位基因頻率來推斷它們在白血病發(fā)生過程中的順序，結(jié)果表明DNMT3A基因突變可能在造血干細(xì)胞中首先發(fā)生，然后是髓系祖細(xì)胞中的NPM1基因突變，第三是FLT3基因突變。大量研究證明，AML患者不同的基因突變可引起相似或不同的免疫表型及血液學(xué)特征[10]。

70例初診AML患者中，除M3、M6型外，M1、M2、M4、M5型均有NPM1基因突變發(fā)生，其中M1型突變率最高(50.00%)，其余依次為M4、M5、M2型。國內(nèi)外部分研究結(jié)果是以M4型或M5型突變率較高[3,11]，這與本研究結(jié)果不同，但部分國內(nèi)研究結(jié)果[12]與本研究結(jié)果一致。70例AML患者中NPM1基因突變檢出率為18.57%，低于文獻(xiàn)[3,13-14]的報道，而高于SU等[15]的報道；NPM1基因突變在非AML-M3的檢出率為22.03%(13/59)，與相關(guān)報道亦有不同[16-17]。上述問題可能的原因：患者組成及種群差異；收集的NPM1基因突變陽性初診AML患者樣本不多。此外，據(jù)文獻(xiàn)[9]報道，NPM1基因在AML發(fā)生、發(fā)展過程中表達(dá)較穩(wěn)定，該基因突變可在完全緩解后轉(zhuǎn)陰，而在疾病復(fù)發(fā)時重新被檢出，提示該基因突變檢測可作為AML療效判斷以及復(fù)發(fā)監(jiān)測的一種有效手段。

綜上所述，NPM1突變是AML患者常見的一種分子學(xué)異常，突變發(fā)生率較高，CD34陽性率降低。免疫表型檢測可提高AML診斷的準(zhǔn)確性。