閔鵬飛 ， 宋建臣 ， 許應(yīng)天 ， 王 浩 ， 楊冰祎 ， 千慧燕 ， 張 爽 ， 賈立軍

(1.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心 延邊大學(xué) ， 吉林 延吉 133002 ； 2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 吉林 延吉 133002)

牛瑟氏泰勒蟲病是由瑟氏泰勒蟲(Theileriasergenti，T.sergenti)引起的一種通過蜱作為中間宿主傳播的血液原蟲病。其主要在牛體內(nèi)的紅細(xì)胞中寄生?？潞帐紫仍诜侵捱_(dá)累斯薩拉姆的牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)泰勒蟲[1]；隨后泰勒也發(fā)現(xiàn)了這種蟲體，并將其歸類為一種小梨形蟲[2]；貝坦科爾特等根據(jù)形態(tài)學(xué)上的差別，建議將泰勒蟲分為梨形蟲屬和泰勒屬2個(gè)屬[3]。牛瑟氏泰勒蟲病首次于俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[4]。自泰勒蟲發(fā)現(xiàn)以來，世界各地便陸續(xù)報(bào)道該病。近年來，東亞、南亞、歐洲、北美洲等地均有關(guān)于泰勒蟲感染的報(bào)道[5-7]。我國(guó)于1983年報(bào)道在貴州首次發(fā)現(xiàn)瑟氏泰勒蟲[8]。瑟氏泰勒蟲病的流行與蜱的活動(dòng)區(qū)域、流行狀況密切相關(guān)。該病呈明顯的季節(jié)性與地區(qū)性流行，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失與潛在威脅。

牛瑟氏泰勒蟲病對(duì)牛的危害極其巨大，通過系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)掌握瑟氏泰勒蟲在動(dòng)物中的流行現(xiàn)狀，對(duì)瑟氏泰勒蟲病的有效防控具有重要意義。本調(diào)查應(yīng)用PCR方法對(duì)吉林省琿春、通化、安圖、舒蘭、龍井、遼源、白山共7個(gè)地區(qū)的247份牛抗凝血進(jìn)行檢測(cè)，旨在為防控牛瑟氏泰勒蟲病提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 247份血液樣本采自吉林省琿春、通化、安圖、舒蘭、龍井、遼源、白山共7個(gè)地區(qū)的養(yǎng)牛場(chǎng)，均為無菌采集抗凝血。

1.2 試劑 FastPure Blood DNA Isolation Mini Kit 試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；dNTP Mix、TaqDNA Polymerase、10×TaqBuffer、DL 2 000 DNA Marker等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的合成 根據(jù)牛瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因序列，參照Cao等[9]方法設(shè)計(jì)PCR引物，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table1 PCR amplification primer

1.4 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 血液基因組DNA按照血液基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。應(yīng)用牛瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及條件按照胡詩悅等[10]的方法進(jìn)行。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳完畢后將膠塊置于凝膠成像儀中進(jìn)行觀察。

1.5 克隆載體的構(gòu)建及測(cè)序 利用OMEGA凝膠回收試劑盒對(duì)目的基因片段進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體，連接體系：膠回收產(chǎn)物4 μL，Solution 15 μL，pMD18-T載體1 μL。低溫恒溫水浴鍋設(shè)定溫度16 ℃，將混合物放置水浴鍋中12～14 h后得到連接產(chǎn)物。將連接后的產(chǎn)物于Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于AMP抗性平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。用挑菌環(huán)挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的菌落放入AMP培養(yǎng)液中搖菌擴(kuò)增。使用OMEGA的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，提取完畢的質(zhì)粒分成2份，1份放入-20 ℃冰箱保存以備后續(xù)使用，1份送往長(zhǎng)春生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)序結(jié)果利用NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)，采用MegAlign軟件進(jìn)行基因同源性分析。并對(duì)檢測(cè)的247份樣本進(jìn)行不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)模式、不同性別及不同年齡之間的比較，以及感染牛瑟氏泰勒蟲情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 牛瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因PCR檢測(cè) 牛血液基因組樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得435 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。PCR共檢測(cè)出陽性樣本98份。將擴(kuò)增得到的目的基因經(jīng)轉(zhuǎn)化克隆后送往公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST同源性比對(duì)，98份測(cè)序樣本均與瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因相符(GenBank登錄號(hào)：MH208641.1)。

圖1 部分牛血液樣本PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products from some bovine blood samplesM:DL 2 000 DNA 標(biāo)準(zhǔn); 1～9:牛血液樣本; 10:陽性對(duì)照; 11:陰性對(duì)照M:DL 2 000 DNA marker; 1-9:Bovine blood samples; 10:Positive control; 11:Negative control

2.2 擴(kuò)增基因進(jìn)化分析 采用MegAlign對(duì)擴(kuò)增泰勒蟲18S rRNA基因進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2、3)。擴(kuò)增蟲株18S rRNA-Theileria-cow與BDH3擴(kuò)增蟲株(GenBank登錄號(hào)：MF576178.1)處于同一分支，同源性為100%。與中國(guó)湖北擴(kuò)增蟲株、西班牙擴(kuò)增蟲株、印度擴(kuò)增蟲株的同源性為99.80%，說明擴(kuò)增蟲株與目前流行的蟲株具有普遍同源性。

圖2 不同蟲株間18S rRNA基因同源性比對(duì)Fig.2 Homology of 18S rRNA gene among different insect strains▲：本次試驗(yàn)所得分離株▲：The isolates obtained in this test

圖3 不同蟲株間18S rRNA基因序列進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of 18S rRNA gene sequences among different insect strains▲：本次試驗(yàn)所得分離株▲：The isolates obtained in this test

2.3 不同地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對(duì)采自吉林省7個(gè)不同地區(qū)的共247份血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)。各地牛瑟氏泰勒蟲感染情況見表2。結(jié)果顯示，吉林省7個(gè)地區(qū)的牛群均存在瑟氏泰勒蟲感染。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，除安圖和白山地區(qū)間差異不顯著(P>0.05)外，其他各地區(qū)間均差異顯著(P<0.05)。

表2 不同地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 2 Theileria sergenti infection in different regions

2.4 不同養(yǎng)殖模式下牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對(duì)PCR檢測(cè)的247份牛血液樣本，分析不同養(yǎng)殖模式對(duì)牛瑟氏泰勒蟲感染率的影響。結(jié)果顯示，規(guī)?；B(yǎng)殖和散養(yǎng)條件下均有瑟氏泰勒蟲感染(表3)，散養(yǎng)模式下的牛更易感染瑟氏泰勒蟲，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同養(yǎng)殖模式下牛瑟氏泰勒蟲感染率差異極顯著(P<0.01)。

表3 不同養(yǎng)殖模式牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 3 Theileria sergenti infection in different feeding patterns

2.5 不同性別間牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對(duì)PCR檢測(cè)的247份牛血液樣本，分析牛瑟氏泰勒蟲在不同性別間的流行情況，結(jié)果顯示，不同性別牛均有瑟氏泰勒蟲感染(表4)，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同性別牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 4 Theileria sergenti infection in different sexes

2.6 不同年齡段間牛瑟氏泰勒蟲感染情況 對(duì)PCR檢測(cè)的247份牛血液樣本，分析不同年齡段牛瑟氏泰勒蟲的感染率。結(jié)果顯示，不同年齡段的牛均有瑟氏泰勒蟲感染(表5)，年齡越小的牛越容易感染，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同年齡段間牛瑟氏泰勒蟲感染率差異顯著(P<0.05)。

表5 不同年齡牛瑟氏泰勒蟲感染情況Table 5 Theileria sergenti infection in different ages

3 討論

泰勒蟲病雖不是人獸共患病，但其對(duì)我國(guó)牛、羊等反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成的影響嚴(yán)重。調(diào)查顯示，吉林延邊地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲PCR陽性率為39.10%[11]；山東牛瑟氏泰勒蟲血涂片陽性率為15.40%[12]；江西高安地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲PCR平均陽性率為28.30%[13]；甘肅牦牛瑟氏泰勒蟲血清平均陽性率為73.99%[14]。另據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，由于攜帶寄生蟲的個(gè)體會(huì)在很長(zhǎng)一段時(shí)間中處于低水平的寄生蟲血癥，這時(shí)很難用顯微鏡觀察到蟲體，所以利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)泰勒蟲比血涂片法和血清學(xué)方法具有更高的特異性和靈敏性[15]。本調(diào)查利用PCR法對(duì)采自琿春、通化、安圖、舒蘭、龍井、遼源、白山共7個(gè)地區(qū)的247份牛血液進(jìn)行檢測(cè)，以期了解牛瑟氏泰勒蟲的流行現(xiàn)狀。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，247份血液樣本檢測(cè)出陽性98份，總體陽性率為39.68%。測(cè)序結(jié)果顯示，所有陽性樣本均為瑟氏泰勒蟲感染。不同地區(qū)間牛瑟氏泰勒蟲感染率差異顯著(P<0.05)，其中通化地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲陽性率最高為70.00%，最低為龍井地區(qū)20.00%，出現(xiàn)差異的原因可能與樣本采集地區(qū)的環(huán)境和采樣地附近的蜱蟲種類相關(guān)；不同性別間牛瑟氏泰勒蟲感染率差異不顯著(P>0.05)；不同養(yǎng)殖模式下牛瑟氏泰勒蟲感染率差異極顯著(P<0.01)，散養(yǎng)模式下的牛更易感染，可能與散養(yǎng)模式下管理松散，牛群更易接觸蜱蟲等因素有關(guān)；不同年齡段下牛瑟氏泰勒蟲感染率差異顯著(P<0.05)，1歲以內(nèi)陽性率(56.67%)明顯比3歲以上陽性率(26.80%)高，出現(xiàn)這種情況的原因可能與牛自身的抵抗力和養(yǎng)殖模式相關(guān)。

本調(diào)查與胡詩悅等[10]2013年調(diào)查的感染率(53.4%)有所降低，這與養(yǎng)殖場(chǎng)近年來對(duì)該病的重視程度和防控力度的加大有關(guān)。本調(diào)查證實(shí)吉林省境內(nèi)牛瑟氏泰勒蟲感染依然普遍存在，尤其是琿春、通化地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲病依然處于高發(fā)狀態(tài)。蜱蟲是泰勒蟲的主要傳播媒介，建議養(yǎng)殖企業(yè)要加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，尤其在蜱蟲流行的地區(qū)要實(shí)施科學(xué)防蜱、滅蜱，提高環(huán)境衛(wèi)生，從傳染源頭杜絕牛瑟氏泰勒蟲病的發(fā)生[16-17]。本調(diào)查為牛瑟氏泰勒蟲病的有效防控提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)牛瑟氏泰勒蟲的研究具有積極意義。