戴 銀 ， 胡曉苗 ， 趙瑞宏 ， 張丹俊 ， 潘孝成 ， 沈學懷 ， 尹 磊 ， 周學利 ， 侯宏艷

(安徽省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 安徽 合肥 230031)

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，嚴重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的急性傳染病[1]。該病主要臨床癥狀為腹瀉、呼吸困難、拒食、腳軟等，傳播方式較多，尤其是雛番鴨易感染發(fā)病，死亡率可高達80%[2-3]，對我國很多地方番鴨的健康養(yǎng)殖已經(jīng)造成嚴重影響[4-8]。MDPV為細小病毒科、依賴病毒屬成員，線性、單鏈DNA病毒，基因組大小約5kb?；蚪M包括2個開放閱讀框(Open read frame,ORF)，左側ORF編碼非結構蛋白NS，右側ORF編碼結構蛋白 VP。NS蛋白參與病毒DNA復制及基因表達，對宿主細胞產(chǎn)生毒性作用等；VP蛋白編碼的病毒粒子衣殼蛋白，誘導機體產(chǎn)生中和抗體，與病毒致病力密切相關[9-12]。2種蛋白作為病毒的重要結構成分，均具有不可替代的生物學功能。2019年本課題組對安徽省2個不同地方的MDPV毒株進行了分離鑒定，本試驗通過分段擴增獲得了2株番鴨細小病毒基因組NS和VP全長基因序列并進行了分析，為下一步研究水禽細小病毒宿主差異、分子致病機理和遺傳變化規(guī)律提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株基因組DNA 番鴨細小病毒安徽分離株AH1901和AH1902基因組DNA由安徽省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室分離、鑒定并保存。毒株AH1901和AH1902分離于2019年，分別來自安徽合肥和安慶地區(qū)。

1.1.2 主要工具酶和試劑 DNA Marker DL2 000等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；Taq酶、dNTP、瓊脂糖(電泳純)等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中MDPV毒株SAAS-SHNH的基因組序列(登錄號：KC171936)，用Primer Premier 5.0軟件設計5對特異性擴增引物。P1：5′-GACATGGCACTTTCTAGG-3′，P2：5′-TAGTTCTTTGCTGCTCTGTT-3′；P3：5′-TCAACTGTAGCTCCCCTTAT-3′，P4：5′-AGACATAGCTATTTTGAATC-3′；P5：5′-GCTCTTTGCTTCAGTTGCTC-3′，P6：5′-CAGGTTCGGAGCCTTCGGTG-3′；P7：5′-ACCTGTGGCAGCACCTAA-3′，P8：5′- CGCCTTTCACAGCCTTTT-3′；P9：5′-AAAAGGCTGTGAAAGGCG-3′，P10：5′-GAACGAACCCTCCAATGA-3′。預期目的擴增片段大小分別為680、1 270、890、809 bp和920 bp，序列拼接后基因片段全長4 190 bp，包括完整的NS基因和VP基因編碼區(qū)。

1.2.2 基因組的分段擴增 以基因組DNA為模板，分別采用P1 和P2、P3 和P4、P5 和P6、P7 和P8、P9 和P10為上下游引物擴增。PCR反應體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL,上下游引物各1.0 μL，DNA 2 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補足50 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，45 ℃/51 ℃/51 ℃/53 ℃/53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司純化、測序。

1.2.3 基因序列分析 應用DNASTAR軟件拼接基因序列，DNASTAR中的Megalign程序進行同源性分析。采用Clustal X 1.83軟件分析比對基因序列，MEGA 5.0軟件Neighbor-joining方法構建遺傳進化樹，聚類分析的可靠性用Bootstrap置信區(qū)限檢測，同時每1 000 Bootstrap測試結果大于50%的在節(jié)點上顯示?；蚱纹唇雍螳@得NS基因和VP基因全長核苷酸序列，與GenBank中登錄的MDPV、鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)毒株相應序列進行對比分析。參考毒株基因組GenBank登錄號及信息見表1。

表1 參考毒株信息Table 1 Details of reference virus strains

2 結果

2.1 基因的擴增 以提取的分離株AH1901和AH1902基因組DNA為模板，P1和 P2、P3和P4、P5和 P6、P7和P8、P9和P10為PCR引物，分別擴增獲得了約680、1 270、890、809 bp和920 bp的特異性DNA片段(圖1)，并將擴增的基因產(chǎn)物測序。獲得的序列與GenBank中登錄的MDPV全長基因進行比對，顯示均為目的基因序列。

圖1 基因組的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of viral genomeM：DNA標準分子量; 1～5：分別以P1和 P2、P5和 P6、P3和P4、P7和P8、P9和P10為引物的PCR產(chǎn)物M:DNA Marker; 1-5:PCR products of P1 and P2,P5 and P6,P3 and P4,P7 and P8,P9 and P10 primers,respectively

2.2 基因序列特征 序列分析可見，擴增獲得的2個MDPV基因組片段均包括完整的NS基因和VP基因，其中NS基因全長1 884 bp，NS1和NS2長度分別為1 884 bp和1 356 bp，二者共用同一終止密碼子；VP基因全長2 199 bp，VP1、VP2和VP3長度分別為2 199、1 764 bp和1 605 bp，同樣三者共用同一終止密碼子。將所有獲得的2個MDPV毒株及20個參考毒株基因核苷酸序列經(jīng)Clustal X 1.83軟件分析后可知，NS基因核苷酸替代較少，較為保守；而VP基因序列核苷酸替代較多，變異較為明顯。

2.3 遺傳進化分析 采用MEGA分析軟件，將22條水禽細小病毒基因組序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結果顯示，所比對的序列明顯分為GPV和MDPV兩個類群。安徽分離毒株AH1901和AH1902基因遺傳距離較近，處于同一分支。二者與MDPV國內分離株ZJ-JH-2013基因遺傳距離較近。與安徽分離株AH1401、AH-AQ-2015及上海分離株SAAS-SHNH遺傳距離相對較遠，尤其與P1疫苗株、匈牙利毒株FM、國內毒株FZ91-30等5個MDPV分離株親緣關系較遠，位于不同分支。

圖2 基因組序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of genome sequences▲：本試驗分離的病毒株▲：The virus isolates of this experiment

2.4 基因同源性分析 將MDPV和GPV的NS基因核苷酸序列進行同源性比較(圖3)，結果表明，所比對的基因組序列同源性介于80.9%～99.9%，其中MDPV毒株之間同源性在98.0%以上。安徽分離株AH1901與AH1902基因序列同源性為99.8%，與GPV同源性相對較低，同源性均介于81.0%～83.2%。二者與MDPV毒株ZJ-JH-2013基因序列同源性最高，均為99.8%，與上海分離毒株SAAS-SHNH同源性均為99.6%，與安徽分離株AH1401同源性均為99.5%，與毒株AH-AQ-2015分別為99.7%和99.6%。與疫苗株P1、匈牙利分離株FM序列同源性相對較低，均為98.7%。

圖3 NS基因核苷酸序列同源性Fig.3 Homology of NS nucleotide sequences

將VP基因序列進行同源性比較(圖4)，結果表明VP基因核苷酸序列同源性介于79.6%～100.0%，其中MDPV之間同源性在88.9%以上。安徽分離株AH1901和AH1902基因序列一致，與GPV基因同源性均較低，與鵝源GPV毒株SYG61v僅為87.9%。與分離株ZJ-JH-2013、AH-AQ-2015同源性較高，達99.8%。與MDPV上海分離株SAAS-SHNH、安徽株AH1401基因序列同源性為99.7%，與疫苗株P1及國外分離株FM基因序列同源性僅為88.9%和89.3%。

圖4 VP基因核苷酸序列同源性Fig.4 Homology of VP nucleotide sequences

3 討論

本試驗通過分段PCR擴增獲得了2個MDPV安徽分離株AH1901和AH1902的NS和VP全長基因，并與GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的20個MDPV、GPV基因組序列進行了比對。序列分析可知，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分別為1 884 bp和 2 199 bp；VP是主要的免疫保護性抗原基因，初步分析可見相對MDPV的NS基因，VP基因核苷酸序列變異程度較高，這與已有相關研究基本一致[13-14]。進化分析顯示，分離株AH1901和AH1902遺傳距離較近，二者與2013年國內分離的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因序列親緣關系最近，與重組型毒株SAAS-SHNH、2014年分離的安徽毒株AH1401，尤其與疫苗株P1及匈牙利毒株FM基因序列距離相對較遠。核苷酸序列同源性分析可見，國內分離的MDPV基因同源性均較高，安徽分離株AH1901與AH1902的NS基因序列同源性為99.8%，與VP基因序列一致。與遺傳進化分析結果相似，安徽分離株AH1901和AH1902與疫苗株P1及國外分離株FM的同源性均較低。此外，雖然進化樹顯示二者與毒株AH1401、SAAS-SHNH、AH-AQ-2015位于不同分支，但與分離株ZJ-JH-2013一樣，NS基因和VP基因核苷酸序列同源性均較高。結果顯示，近年國內的MDPV分離株總體遺傳變異程度較小，基因組特性相對穩(wěn)定[14]，但個別毒株之間仍存在一定差異，可能導致病毒株感染力的不同。

研究發(fā)現(xiàn)相對GPV，MDPV的宿主范圍較窄，僅感染番鴨，但經(jīng)常存在混合感染，甚至發(fā)生基因重組現(xiàn)象[15-17]。與經(jīng)典型MDPV相比，重組型MDPV對雛番鴨的致死率更高，且多見腸道栓塞,已在我國流行多年[18-20]。毒株AH1401與SAAS-SHNH被認為是MDPV與GPV重組型的水禽細小病毒株[21-23]，但AH1901和AH1902與重組型MDPV毒株有一定差異，不屬于同一分支亞群。二者均是2019年在安徽省2個不同地方分離獲得的MDPV毒株，與分離株ZJ-JH-2013可能來源于同一經(jīng)典毒株。近年重組型MDPV備受關注，但經(jīng)典型毒株造成的危害也不能忽視。安徽省番鴨群細小病毒病頻發(fā)，一方面與傳統(tǒng)病毒株的變異，不科學的飼養(yǎng)管理相關，也可能與安徽流行株與使用較為廣泛的疫苗株同源性相對較低，疫苗難以有效防控有一定關系。